1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2300-2009 国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法Detection of mosquito-borne chikungunya virus at frontier port 2009-07-07发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局目Ij1=1 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局。SN/T 2300-2009 本标准主要起草人:黄吉城、郑要、洪烨、李小波、幸芦琴、师永霞、钟玉清、相大鹏、郭波旋、胡龙
2、飞、陈永红。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 标准分享网免费下载SN/T 2300-2009 1 范围国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法本标准规定了国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法，包括标本采集、处理、检测程序、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的实验室检验。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 19489 实验室
3、生物安全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 基孔肯雅病毒chikungunya virus 基孔肯雅病毒是单股RNA病毒，属于披膜病毒科甲病毒属。病毒颗粒呈球形，平均直径42日m，相对分子质量为4.3X108，沉降系数为46S。该病毒感染人可引起基孔肯雅热，主要临床表现为发热、关节疼痛、皮摩和轻度出血等。本病潜伏期3d12d，伊蚊是其主要传播媒介。3.2 实时荧光RT-PCRreal-time f1 uorescence RT-PCR 实时荧光RT-PCR方法是在常规RT-PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核昔酸，两端分别标记一个报告基团和一个碎灭荧
4、光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被碎灭基团吸收;PCR扩增时，利用Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和碎灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每个反应管内的荧光信号达到设定的阔植时所经历的循环数，用Ct植Ccycle thresl叫d)表示。4 实验室生物安全要求4.1 基孔肯雅病毒培养和动物感染实验应在生物安全三级CBSL-3)实验室内进行。4.2 未经培养的基孔肯雅病毒感染性材料的操作应在生物安全二级CBSL-2)实验室内进行。4.3 基孔肯雅病毒相关的灭活材料和元感染性材料操作可在生物安全一级CBSL-l)实验室内进行。4.4 基孔肯雅病毒感染性
5、材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814，4.5 其他要求按GB19489进行。5 主要仪器设备主要仪器设备如下:荧光定量PCR仪;1 SN/T 2300-2009 二级生物安全柜;CO2培养箱;倒置显微镜;高压灭菌器;70C超低温冰箱(或液氮罐); 冷冻离心机(带密封的离心安全杯，最大离心力20OOOg); 玻璃研磨器;涡旋器。6 主要试剂舌6.1 标本处理液:在新鲜配击制l的9町5m丑1LMEM(最低民必须培养基配方见附录A)中加入56C热灭j活3川Om丑1m口1的月胎台牛血清2mL、，1m丑1L庆大霉素(5000 川fJ-哈咆g/咄/素(青霉素G10000 U/m丑L、链霉素100
6、00川fJ-咆g/咄/6.2 Har此11也k飞S液:配方见附录A。6.3 核酸提取试剂:用QIAampViral RNA Kit，详见试剂盒说明书1)，内含AVL、AW1、AW2和AVE等成分。6.4 Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit，美国Ambion公司产品1)。6.5 DEPC水。6.6 实时荧光RT-PCR检测的引物和探针:CHIK-FP 5-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3 CHIK-RP 5-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3 CHIK-probe 5 FAM-TGCCACATG!GA-BHQl-3 (LNA探针，下划线斜黑
7、体字母表示LNA修饰碱基)。7 标本的采集与处理7.1 根据监测任务等实际工作需要采集所需数量的蚊子标本(参见附录B)。7.2 将采集的蚊子直接放入20 C冰箱30min以上冻死后，取出，分类编号，按30只一份，装入2mL螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号，立即放入液氮罐或干冰内(-70C以下)运输或保存。7.3 标本的处理:在冰上操作。从70 C以下超低温冰箱中取出蚊标本，倒入研磨器中，加入Hanks 液1mL吹洗，弃去液体后加入1mL标本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入l. 5 mL eppendorf离心管，平衡后置预冷4C的离心机上，12000 r/min离心10
8、min。取上清液提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，或接种组织细胞进行病毒分离。剩余的蚊标本研磨液需保存在70 C 以下超低温冰箱以备复查。8 检验程序8. 1 C6/36细胞培养分离病毒8. 1. 1 在96孔平底组织培养板中，每孔加入50fJ-L蚊媒标本研磨液，每份标本平行加2孔，预留2孔作为正常细胞对照。8. 1.2 每孔加入200LC6/36细胞(1X 106个/mL)。2 1) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。标准分享网免费下载SN/T 2300-2009 8. 1.3 加盖，置CO2培养箱(33C
9、 ，5%二氧化碳，湿度80%)中培养7d，每天于倒置显微镜下观察细胞病变化PE)情况并作好记录。8. 1.4 不管细胞是否出现CPE，每份标本均连续传3代，3代后出现CPE的孔可将上清液吸出接种细胞瓶(管)进行增殖，或置70 C超1冰箱保存，待作进一步鉴定。8.1.5 病毒培养的结果观察:基孔肯雅病毒在C6/36细胞上的典型细胞病变化PE)为细胞肿胀、破碎、团聚、融合、脱落。8. 1.6 病变的细胞按8.2和8.3进行病毒检测。8.2 病毒核酸提取8.2. 1 取蚊标本研磨液或细胞培养上清140L加入560L裂解液(AVL)，在旋涡混合器上振荡15s 1昆匀，室温静置10min。8.2.2 加
10、入560fJ-L元水乙醇终止反应，在旋涡混合器上振荡15d昆匀。8.2.3 裂解后的液体分两次移入管柱，每次8000 r/min离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。8.2.4 加500L洗液(AWl)至管柱上，8000r/min离心1min，弃去AW1。8.2.5 加500L洗液(AW2)至管柱上，14000r/min离心3mi口，弃去AW2。进一步离心14000r/ min 1 min以彻底去除残留在膜上乙醇。8.2.6 加入60fJ-L洗脱液(AVE)，室温静置1min, 8.2.7 将管柱置于l.5 mL离心管上，4C离心8000r/min 1 min，得到的RNA即可进
11、行实时荧光RT-PCR检测。8.3 实时荧光RT-PCR检测方法8.3. 1 反应液的准备设置20fJ-L反应体系，每个待检标本反应液的组成为:元RNA酶的灭菌双蒸水2.2 fJ- L 2XRT-PCRBuffer 10L 20M CHIK-FP 0.5L 20 fJ- M CHIK-RP 1 fJ- L 5 fJ- M CHIK-Probe 0.5 fJ- L 25 X RT-PCR Enzyme Mix 0.8 fJ- L 模板RNA5 fJ- L 8.3.2 扩增程序在全自动荧光定量仪AppliedBiosystems 7 500 Fast Real-Time PCR Systems2)
12、上检测时，扩增程序为:50C 10 min , 95 C 10 mi口，95C 10 s62 C 30 s 45(检测荧光信号)循环。若仪器为RocheLightCyclerReal Tit时PCR扩增仪2)，则扩增程序为:50 C 10 min , 95 C 10 min , 95 C 5 s62 C 20 s 45循环。由于不同的荧光定量PCR仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。9 结果判定与报告9.1 反应结果应同时符合阴性对照元扩增曲线而阳性对照Ct屿，且元明显扩增曲线，报告为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检2) 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如
13、果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3 SN/T 2300-2009 测阴性。9.3 阳性结果:样品Ct植40，并有明显扩增曲线，报告为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检测阳性。9.4 可疑结果:样品Ct直在4045之间的标本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该标本判断为基孔肯雅病毒核酸荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性4 标准分享网免费下载SN/T 2300-2009 附录A(资料性附录)MEM和Hanks液配方A.l MEM配方MEM配方见表A.l。表A.lMEM配方成分用量/(mg/L)成分用量/(mg/L) 氯化钙200 L苏氨酸48 氯化主甲400 L色氨酸1
14、0 元水硫酸楼97.67 L酶氨酸36 氯化纳6800 L绩氨酸46 元水磷酸二氢纳121. 74 D葡萄糖1000 L精氨酸盐酸盐126 盼红6 L脱氨酸盐酸盐31 D泛酸钙1 L谷氨眈胶292 氯化胆碱1 L组氨酸盐酸盐42 叶酸1 L异亮氨酸52 1肌醇2 L亮氨酸52 烟眈胶1 L赖氨酸盐酸盐72. 5 盐酸口比哆自主1 L蛋氨酸15 核黄素o. 1 L苯丙氨酸32 盐酸硫胶1 A.2 Hanks 液配方磷酸二氢锦o.06 g，氧化铀8.0g，碳酸氢铀O.35 g，氧化专甲0.4g，葡萄糖l.0 g，磷酸氢二铀CNa2HP04 H20)0. 06 g，加水至1000 mL, Hank
15、s液可以高压灭菌，分装于4C下保存。5 SN/T 2300-2009 附录B(资料性附录)蚊虫标本的采集、运输和保存B. 1 准备B. 1. 1 幼虫捕捞器材水勺和水网，宽口长、短吸管，青霉素瓶或其他小瓶，幼虫饲养笼。B. 1.2 成蚊采集器材诱蚊帐，诱蚊灯，电动吸蚊器，捕蚊髓场，捕虫网、集蚊袋、于电筒等。B. 1.3 其他器材液氮罐(含液氮)或干冰、螺口血清管、纱布、工作记录表、小标签纸、记录笔、油性记号笔(耐低温)等。B. 2 采集方法B. 2.1 蚊虫滋生地选择白纹伊蚊白天在人房、竹林活动:致倦库蚊在人房;中华按蚊、三带喋库蚊在既舍;小容器收集的蚊幼多为伊蚊、库蚊;大型静水(稻田、芜白田
16、、池泪、低洼积水等收集的是中华按蚊、窄卵按蚊、三带喋库蚊;污水沟、坑、清水粪缸收集的多为淡色库蚊、致倦库蚊。B. 2. 2 蚊虫采集B. 2. 2.1 电动服蚊器人工诱捕法选择各种蚊虫栖息的场所，如库蚊以人房、牛棚、猪舍作为捕捉点于日落后1h1.5h开始捕捉，伊蚊以竹林、香蕉园等半家栖环境于上午和近黄昏时段用电动吸蚊器捕捉。B. 2. 2. 2 捕蚊磁场自动诱捕法选择各种蚊虫栖息的场所，放置一台捕蚊酷场，以液化石油气为气源和动力源，按说明连续开启捕蚊髓场自动诱捕蚊虫，诱捕2h4 h或一夜。B. 2. 2. 3 人帐法在蚊虫滋生地附近，挂一大型蚊帐，将帐顶支平，四角拉开，下缘离地面30cm40
17、cr丑，人在帐内诱蚊入帐，以吸蚊器连续捕蚊。B. 2. 2. 4 灯诱法将诱蚊灯悬挂于蚊虫滋生地、猪场、牛棚、居民点周围的空地上，离地1ml. 5 m，傍晚开启电源进行自动诱捕，诱捕2h4 h或一夜。B. 2. 2. 5 网捕法操作时，采集者于持网柄，伸直胳膊作形挥网，每次以55次/mi日的频率采集。B. 2. 2. 6 勺捞法选择各种蚊幼滋生的场所(池塘、模流、沟渠、水潭、稻田等)用金属制的标准捞勺(容积约400mL 或市售的小奶锅安一柄即成)或水网(粗铁线缝上纱布制成)，于幼虫滋生的水体，在离岸1m以内，随机采集水样，如有各龄幼虫或蝠，用粗口吸管吸入广口瓶内。B. 2. 3 蚊虫标本的现场
18、处理将收集于集蚊袋中的蚊子连同集蚊袋一起直接放入20 C冰箱冰30mi日以上冻死后，取出，分类编号，按30只一份，装入2mL螺口血清管内，旋紧管盖，做好编号，置液氮(或70 C超低温冰箱或掩埋于干冰)中冻存待检。每支标本管的编号应与记录表格一一对应，原始记录表格要详细填写。6 标准分享网免费下载SN/T 2300-2009 B. 2. 4 蚊虫标本的保存要保持蚊体内虫媒病毒的活性，分装好的蚊标本需保存在70 C以下，直到进行标本检测。液氮的温度为196 C，因此最好能将标本保存于液氮中;干冰的温度为82 C，也可将标本掩埋于干冰中保存，但用干冰保存时不可直接将标本放置于干冰上，因为干冰上面的温
19、度仅达30 C左右，不足以长时间保持病毒的活性;-70C以下超低温冰箱是实验室常用保存于病毒类标本的容器。采集好的蚊虫分类分组后，装入冻存管中(或者是螺口的塑料血清管中)，用耐低温油性记号笔写上编号，并将标本管放入纱布袋中，纱布袋的封口线上用胶布缠上并记录采集的时间和地点，将纱布袋放入液氮罐或掩埋于干冰中。B. 2. 5 蚊虫标本的运输标本运输的原则是:标本一定要放置在液氮或干冰中，在运输中保持冷链。对陆路运输送检的标本，尽可能采用液氮送检，即将标本连同装标本的液氮罐一并运送到目的实验室，并确保标本送到实验室时仍浸泡于液氮中;对于较远距离运输的标本，建议采用航空托运的方式送检。由于民航部门不允
20、许液氮随机托运，只能采取干冰送检，方法如下:送检人员在登机的当天将标本从液氮(或70 C超低温冰箱)中取出，立即装入含10kg干冰的泡沫箱中打包，送机场随机托运，到达目的地后随即将标本送到实验室，并确保标本送到实验室时干冰仍覆盖标本。白CON-00的NH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒的检测方法SN/T 2300-2009 沃中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷沃印张o.75 字数13千字2009年10月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2009年10月第一版印数1-2000定价16.00元沃书号:155066.2-19914 标准分享网免费下载SN/T 2300-2009
