1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2301-2009 国境口岸登革病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法Rapidly detecting method for dengue virus by real-time fluorescence RT-PCR at frontier port 2009-07-07发布2010-01-16实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 2301-2009 目Ij1=1 本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人:郑要、黄吉城、洪烨、李
2、小波、幸芦琴、师永霞、钟玉清、相大鹏、郭波旋、胡龙飞、陈永红。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 标准分享网免费下载1 范围国境口岸登革病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法SN/T 2301-2009 本标准适用于国境口岸入出境人或蚊类携带登革病毒的实时荧光RT-PCR快速检测，包括检测对象、标本采集和处理，检测程序，结果判定及报告。本标准适用于国境口岸入出境人员或蚊类携带登革病毒的实验室检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方
3、研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。人间传染的病原微生物名录(卫生部2006年)3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 登革病毒dengue virus 登革病毒属黄病毒科黄病毒属，包括I、H、皿、N四种血清型，是有包膜的单股正链RNA病毒。登革病毒可感染人，并引起登革热，严重者甚至可引起登革出血热或登革休克综合征。埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革病毒的主要传播媒介。3.2 实时荧光RT-PCRreal-time f1 uorescence RT-PCR 实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan7(解探针法，其原理是在常规RT
4、-PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核昔酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光碎灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被碎灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光碎灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。4 缩略语下列缩略i吾适用于本标准。4.1 RT-PCR reverse trancription polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链式反应。4.2 Ct1直cycIethreshol
5、d 循环阔值，每个反应管的荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数。1 SN/T 2301-2009 4.3 MEM minimal essential medium 最低必须培养基。4.4 RNA ribonucleic acid 核糖核酸。4.5 DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙醋。4.6 FAM 6-carboxy-f1 uorescein 6援基荧光素，一种荧光报告基团。4. 7 MGB minor groove binger 小沟结合物，一种荧光碎灭基团。4.8 BHQ black hole quencher 黑洞碎灭基团。4.9 LNA locked n
6、ucleic acid 锁核酸。5 生物安全措施中华人民共和国卫生部发布的人间传染的病原微生物名录规定，登革病毒危害程度分类为第三类，所有有关登革病毒的实验室操作应按照以下规定执行:6 对象登革病毒培养和动物感染实验应在生物安全二级CBSL-2或ABSL-2)实验室内进行;未经培养的登革病毒感染性材料的操作应在生物安全二级CBSL-2)实验室内进行;登革病毒相关的灭活材料和元感染性材料操作可在生物安全一级CBSL-l)实验室内进行;登革病毒感染性材料运输包装分类为A类(仅培养物为A类)，UN编号为UN2814，疑似感染登革病毒的入出境人员;疑似携带登革病毒的媒介蚊虫。7 仪器和设备2 需要如下
7、仪器设备:荧光定量PCR仪;生物安全柜;普通冰箱;70 C超低温冰箱;普通台式离心机;高速冷冻离心机(转速可达20OOOg); 微量可调移液器(10L、100fJ- L, l 000 fJ-L)及配套带滤芯吸头;标准分享网免费下载8 试剂Eppendorf管(1.5mL); 涡旋器。8.1 MEM和Hanks液商业化产品，也可参见附录A配制。8.2 标本处理;在SN/T 2301-2009 在新鲜配制的95mL MEM中加入56C热灭活30min的胎牛血清2mL、1mL庆大霉素(5000g/mL)、1mL两性霉素B(250fJ-g/mL)和1mL青链霉素(青霉素G10000 U/mL、链霉素1
8、0000g/mL) ，用7.5%碳酸氢铀榕液调至pH7.2，8.3 核酸提取试剂用病毒RNA提取试剂盒QIAampViral RNA Kit，德国Qiagen公司产品lV内含AVL、AW1、AW2，AVE等成分。8.4 实时荧光RT-PCR试剂用Ag-Path-IDTMOne step RT-PCR Kit，美国Ambion公司产品1)8.5 DEPC 740，且元明显扩增曲线，报告为登革病毒荧光RT-PCR检测阴性;阳性:Ct植40，并有明显扩增曲线，报告为登革病毒荧光RT-PCR检测阳性;Ct直在4045之间的标本建议重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该标本判断为登革病毒荧光RT-PC
9、R检测阳性，否则为阴性。10.4 阳性结果说明登革病毒荧光RT-PCR检测阳性的标本可判定被检病人或蚊虫正在感染登革病毒。J SN/T 2301-2009 附录A(资料性附录)MEM和Hanks液配方A.1 MEM配方MEM配方见表A.l。表A.1MEM配方成分用量/(mg/L) 成分用量/(mg/L)氯化钙200 L苏氨酸48 氯化主甲400 L色氨酸10 元水硫酸楼97. 67 L酶氨酸36 氯化纳6800 L绩氨酸46 元水磷酸二氢纳121. 74 D葡萄糖1000 L精氨酸盐酸盐126 盼红6 L脱氨酸盐酸盐31 D泛酸钙1 L谷氨眈胶292 氯化胆碱1 L组氨酸盐酸盐42 叶酸1 L
10、异亮氨酸52 i肌醇2 L亮氨酸52 烟眈胶1 L赖氨酸盐酸盐72. 5 盐酸口比哆自主1 L蛋氨酸15 核黄素o. 1 L苯丙氨酸32 盐酸硫胶1 A.2 Hanks 液配方磷酸二氢锦CKHzP04)0.06 g，氧化铀CNaCl)8. 0 g，碳酸氢铀CNaHC03)0.35 g，氧化专甲CKCl)0.4 g，葡萄糖l.0 g，磷酸氢二号内CNazHP04 Hz 0) O. 06 g，加水至1000 mL, Hank s液可以高压灭菌，分装于4C下保存。6 标准分享网免费下载白CON-0的NH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸登革病毒的实时荧光RT-PCR快速检测方法SN/T 2301-2009 兴中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴印张O.75 字数12千字2009年10月第一次印刷开本880X12301/16 2009年10月第一版印数1-2000定价16.00元兴书号155066.2-19915SN/T 2301-2009
