1、ICS 67040X 00中华人民共和国国家标准农业部1025号公告一172008动物源性食品中呋喃唑酮残留标示物残留检测酶联免疫吸附法Enzyme-linked Immunosorbent Assay Method for Determinationof Marker Residue of Furazolidone in Food-producing Animals20080429发布 2008-0429实施中华人民共和国农业部发布刖 置农业部1025号公告一172008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：袁宗辉
2、、刘宇、彭大鹏、王玉莲、黄玲利、陶燕飞、常超、陈冬梅。本标准系国内首次发布。农业部1025号公告一172008动物源性食品中呋喃唑酮残留标示物残留检测 酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物可食性组织中呋喃唑酮残留标示物3一氨基一2一嗯唑烷酮(3一amino一2 oxazolidnone，AOz)残留量酶联免疫检测方法的制样和检测方法。本标准适用于猪肌肉、猪肝脏、鸡肌肉、鸡肝脏和鱼肉中3一氨基2嗯唑烷酮残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议
3、的各方研究是否可使用这砦文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规则和试验方法3制样3 1样品的制备取新鲜或冷冻的空白或供试组织，去除脂肪和筋膜(鱼肉去皮)，绞碎均质。3 2样品的保存一20贮存备用，保存期6个月。4测定方法4 1方法提要试料中加入苯甲醛，使之与3一氨基一2一嗯唑烷酮衍生形成衍生物，经提取后，提取物与结合在酶标板上的抗原共同竞争抗体，再与酶标抗体反应，形成的酶标记抗原抗体复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值计算试料中3氨基一2一嗯唑烷酮的含量。4 2试剂和材料以下所用试剂，除特别注明者外，均为分析纯；水为
4、符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1 AOZ标准品4 2 2盐酸。4 2 3氢氧化钠。4 2 4三羟甲基氨基甲烷。425 5moLL盐酸溶液量取盐酸417 mL，加水稀释至100 mL，混匀。4 2 6 1moLL氢氧化钠溶液称取氢氧化钠40 g，用水溶解，并定容至100 mL。4 27 5 mmoLL三羟甲基氨基甲烷溶液准确称取三羟甲基氨基甲烷0605 7 g，用水溶解，并定容至1 000 mL。428呋喃唑酮残留标示物检测试剂盒材料】农业部1025号公告一1720084 2 8 1酶标板。4 2 8 2标准溶液。4 2 83抗体。428 4抗体工作液根据试剂盒中说明，用样本稀释液将
5、抗体(4283)溶解，混匀后备用。4 2 8 5酶标记抗体。4 2 86酶标抗体工作液根据试剂盒中说明。用样本稀释液将酶标记抗体(4285)溶解，混匀后备用。4 2 8 7衍生液。428 8提取液。4 289浓缩样本稀释液。4 2 8 10样本稀释液将浓缩样本稀释液(4289)按试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。4 2 8 11浓缩洗涤液。4 2 8 12洗涤液将浓缩洗涤液(42811)按试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。42813底物液。4 2 8 14终止液。43仪器和设备4 3 1恒温水浴锅。4 3 2恒温箱温度范围为室温至60T?O5。4 3 3冷冻离心机转速5 000 r
6、min。434微量移液器1肛110肛l，10 p1100 pl，100 p11 000 pl。4 3 5多道移液器50 pl300一。43 6酶标仪配备450 rim滤光片。4 3 7分析天平感量o000 01 g。438天平感量001 g。439精密pH试纸pH范围6480。44测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取均质后的供试样品，作为供试试料。2取均质后的空白样品，作为空白试料。4 4 2测定条件以下所有操作应在室温(20。C25。C)下进行。呋喃唑酮残留标示物试剂盒中所有试剂均应回升至室温后方可使用。4 4 3提取准确称取试料1 goOl g于10 mL塑料离心管中，加入三羟甲
7、基氨基甲烷溶液3 mL，旋涡30 s，于60。C恒温水浴锅孵育3 h，冷却至室温，加入盐酸溶液150 IlL和衍生液150止，充分振荡，置37。C恒温水浴锅孵育12 h，冷却至室温，加入提取液360“L，旋涡30 S，用氢氧化钠溶液调pH至7002，5 000 rrain 4。C离心20 mln。上清液移至另一容器，作为试样溶液，供ELISA方法测定。4 4 4标准曲线的绘制取各浓度标准溶液(4282)，按445测定方法测定，计算百分吸光度值(45)。以百分吸光度值为纵坐标，标准溶液浓度的自然对数为横坐标，绘制标准曲线。445测定将若于孔条插入微孔架，依次向微孔中加入标准溶液或试样溶液60 a
8、L孔；加入抗体工作液40“L孔，充分混匀后，置于湿盒中，37。C恒温箱孵育1 h。弃去7L中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。加人洗涤液200#L孔，弃去孔内液体，再将酶标板倒置在吸水纸上拍打，重复洗板3次。加入酶标抗体工作液100 r,L孔，置于湿盒中，37。C恒温箱孵育1 h，按上述方法洗板5次。加入底物液100“L孔，置于湿盒中，37。C恒温箱孵育15 min20 mira加入终止液50 I,L孔；在450nm处用酶标仪测量吸光度(OD)值，在加人终止液后60 min内读取吸光值。4 4 6空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。4 5结果计算按公式(1)计算百分吸
9、光度值：百分吸光度值一芋100(1) D0式中：B标准溶液或样品的平均吸光度值；B。零浓度标准溶液平均吸光度值。以百分吸光度值为纵坐标，标准溶液浓度的自然对数为横坐标，绘制出标准曲线。根据实际样品吸光值，从标准曲线上得到相应的浓度后，实际样品中3一氨基一2噫唑烷酮浓度(pgkg)按公式(2)计算。XfV(2) m式中：x试样中3一氨基2嚼唑烷酮残留量，#g虹f从标准血线上得到的药物浓度，r,gL；卜试样溶液的体积(离心后上清液体积，猪肌肉和鸡肌肉为00033 L，猪肝脏和鸡肝脏为0003 5 L，鱼肉为0003L)；m试样质量，妇。5检测方法灵敏度、特异性、准确度和精密度5 1灵敏度本方法的检测限为015“g始；定量限为05 pgkg。5 2特异性3农业部1 025号公告一1 72008本方法与呋喃唑酮交叉反应率为615，与同类的其他化合物交叉反应率小于001。5 3准确度本方法在03#gkg50 pgkg添加浓度的回收率为60120。54精密度本方法的批内相对标准偏差小于20，方法的批间相对标准偏差小于20。附录A(资料性附录)3一氨基一2-gg唑烷酮的标准曲线农业部1 025号公告一172008MAOZ(ugL)图A 1 3一氨基一2一曝唑烷酮的标准曲线蚰蛐蚰如加m0
