1、ICS 67。040X 00中华人民 ，-H、-禾I口，、1 国国家标准农业部1025号公告一202008动物性食品中四环素类药物残留检测酶联免疫吸附法Determination of tetracyclines residue in animal food by immunoassay20080429发布 2008-0429实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部1025号公告一202008本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：刘智宏、叶妮、黄耀凌、郭文林、张纯萍、金银珍、王鹤佳。本标准系首次发布的行业标准。农业部1025号公告一202
2、008动物性食品中四环素类药物残留检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了牛、猪、鸡的肌肉、猪的肝脏、牛奶和带皮鱼肌肉组织中四环素、金霉素、土霉素及多西环素残留检测的制样和酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于牛、猪、鸡的肌肉、猪的肝脏、牛奶和带皮鱼肌肉组织中四环素、金霉素、土霉素及多西环素残留量快速筛选检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 11 2001标准
3、化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则(IsoIEC Directives，Part 3。1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)GBT 6682 1992分析实验室用水规则和试验方法农业部农牧发200311号兽药残留试验技术规范(试行)农业部235号公告动物性食品中兽药最高残留限量3制样3 1样品的制备取适量新鲜或冷冻的空白或供试牛奶。分别取适量新鲜或冷冻的空白或供试牛、猪、鸡的肌肉、猪的肝脏和带皮鱼肌肉组织，绞碎并使均匀。32样品的保存20以下贮存。4测定方法4 1方法提要或原理试样
4、中残留的四环素类药物经提取与结合在酶标板上的抗原共同竞争抗四环素类药物抗体上有限的结合位点，再通过与酶标羊抗免抗体反应，酶标记物将底物转化为有色产物，有色产物的吸光度值与试样中四环素、金霉素、土霉素及多西环素浓度成反比。4 2试剂和材料以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GBT 6682规定的一级水。4 2 1氢氧化钠。422三氯乙酸。423无水甲醇。42 4草酸。4 2 5柠檬酸(c6Hs07HzO)。农业部1 025号公告2020084 2 6磷酸氢二钠(Na。HP0412H2()。4 2 7 乙二胺四乙酸二钠(cloH，aN208Na22H20)。4 2 8草酸甲醇溶液(
5、20 retooLL)取草酸18 g，加甲醇溶解并稀释至1000 mL。4 29柠檬酸缓冲液：分别称取柠檬酸129 g，磷酸氢二钠109 g，乙二胺四乙酸二钠372 g，加水900 mI溶解，用l moLL氢氧化钠溶液调pH至38，稀释至1 000 mI一。42 10 3Xi氯乙酸溶液：称取j三氯乙酸30 g，加水溶解并稀释至1 000 mL。4 2 1 1氢氧化钠溶液(1 tooLL)取氢氧化钠40 g，加水溶解并稀释至100 mL。4 2 12四环素类药物检测试剂盒。42，12 1 四环素类药物系列标准溶液。42122酶标板。42 12 3抗四环素类药物抗体。4 2 12 4酶结合物。4
6、2 12 5底物。4212 6标准液及样品稀释缓冲溶液。4 2 12 7洗液浓缩液。4212 8底物缓冲溶液。4 2 129终止液。4 3仪器和设备431酶标读数仪(配备450 nm滤光片)。4 3 2天平：感量oOl g。4 3 3离心机。4 3 4微型振荡器。4 3 5 pH计。4 3 6固相萃取柱C。i00 mgmL，含碳量16。4 3 7微量移液器单道50 pL，100 pL；多道50#L250 pL。44测定步骤4 4 1试料的制备试料的制备包括：取供试样品作为供试试料。取空白样品作为空白试料。取空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料。4 4 2试样溶液的制备4 4 2 1
7、牛奶取适量牛奶用稀释液经10倍或10倍以上稀释后作为试样溶液供酶联免疫法测定。4 4 2 2组织样品提取方法4 4221提取称取于10 000 rmin匀浆1rain的试样2 g+005 g，加入柠檬酸缓冲液80mL，涡动混匀后，中速振荡30rain，10 000 rmin离心10min，取上清液备用。4 4 2 22净化C。固相萃取柱依次用无水甲醇3 mL、水2 mL预洗。取备用液50 mL过柱，用水2 mL淋洗，挤2农业部1 025号公告一20-2008干。用20mmoLL草酸甲醇溶液10mI洗脱，挤干，收集洗脱液，摇匀，用稀释液lo倍稀释后作为试样溶液供酶联免疫法测定。4 4 2 3组织
8、样品提取方法二称取于10 000 rmin匀浆1 min的试样1 g005 g，加3三氯乙酸溶液(肌肉40 mL，肝脏90mL)，旋涡混匀，中速颠倒振荡20min，10 000 rrain离心10min，取上清液200 pL于L 5mL离心管中，加1 moLL氢氧化钠溶液20 pL，混匀，加缓冲液1(肌肉180 pL，肝脏380 pL)混匀，10 000 rmin离心5 min，取上清液作为试样溶液。4 4 3测定4 4 3 1 四环素类药物检测试剂盒回温至18。C30。C后使用，以下所有操作应在18。C30。C下进行。4432洗液按1份洗液浓缩液+9份水进行稀释。四环素标准溶液、抗四环素类药
9、物抗体溶液、酶结合物、底物溶液等均按1份试剂+9份缓冲液进行稀释和制备”，稀释液均现用现配。4 4 3 3依次向微孔中加入标准溶液或试样溶液50”I。，稀释的抗体50“L”，置微型振荡器上振荡30 s，用封口膜封好，孵育1 h”。弃去孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。每孔加入洗液250“L，弃去孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，重复洗板3次。每孔加入稀释的酶结合物100“L，孵育30 min，按上述方法洗板3次。每孔加底物溶液lOO pL，避光孵育5 min15 rain。每孔加终止液lOO“L，在450 nm波长处测定吸光度值。4 5结果计算和表述按式(1)计算
10、百分吸光度值：百分吸光度值一BB。100(1)式中：B为标准溶液或样品的平均吸光度值；B。为0浓度的标准溶液平均吸光度值。以标准溶液中四环素浓度(ugL)的常用对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。根据试样溶液测得的百分吸光度值从标准曲线上得到相应的四环素类药物浓度，或用相应的软件计算，结果分别按式(2)计算牛奶、鸡肉、猪肉、猪肝、牛肉和鱼肉中四环素类药物残留量：Xf，rt(2)式中：X试样中四环素类药物残留量，单位为ugkg或ugL；c从标准曲线中得到试样中四环素类药物含量，单位为ugkg或ugL；，为试样稀释倍数；”为交叉率”。表1 不同药物的交叉反应率药 物 交叉反应率四环索 1
11、00金霉素 约100多西霉素 约76土霉素 约584 5 1结果判定1)不同品牌试剂盒中试剂的稀释系数略有不同。2)不同品牌试剂盒中试剂的加入量略有不同。3)不同品牌试剂盒的孵育温度与时间略有不同。4)不同品牌试剂盒中各种药物交叉反应率略有不同农业部1 025号公告一202008临界值，按交叉反应率最低的药物(土霉素)计算。在空白牛奶、肌肉和肝脏组织中分别添加土霉素至100 pgL、100 pgkg和300 pgkg，各做20个平行样品进行测定，重复3次，计算含量平均值和标准差。临界值按式(3)计算：L一叉一164S(3)式中：L临界值；X空白添加样品中土霉素含量平均值；s空白添加样品中土霉素
12、含量的标准差。如被测样品中四环素类药物残留量小于临界值时，判断为阴性；当检测结果大于等于临界值时，则结果可疑，应用确证法进行确证。5检测方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法在牛奶中的检测限均低于lO#gL。本方法在牛、猪、鸡的肌肉和带皮鱼肌肉组织中的检测限均低于15 pgkg。本方法在猪肝脏组织中的检测限均低于30 pgkg。5 2准确度本方法在牛奶中lOO“gL添加浓度的回收率为40120。本方法在牛、猪、鸡肌肉和带皮鱼肌肉组织中100tgkg添加浓度的回收率为40120。本方法在猪肝脏组织中300“gkg添加浓度的回收率为40120。53精密度本方法的批内变异系数cV20，批间变异系数cV25。1)不同品牌试剂盒及不同实验室的临界值略有不同。
