1、ICS 65120B 46中华人民共和国国家标准农业部1063号公告一62008饲料中1 3种13一受体激动剂的检测液相色谱一串联质谱法Determination of p-receptor agonists in feedsLiquid chromatography-tandem mass spectrometry20080715发布 2008-0715实施中华人民共和国农业部发布刖 置农业部1 063号公告一62008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料T业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：上海市兽药饲料检测所、国家饲料质量监督检验
2、中心(dL京)、浙江省饲料监察所、北京市饲料监察所。本标准主要起草人：黄士新、沈富林、曹莹、严凤、李丹妮、张文刚、苏晓鸥、朱聪英、蒋音、郑君杰、赵根龙、索德成、应永飞。农业部1063号公告一62008饲料中13种P一受体激动剂的检测液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了饲料中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、克仑普罗、班布特罗、妥布特罗等13种B受体激动剂的液相色谱串联质谱测定方法。本标准适用于饲料中克仑特罗等13种8受体激动剂残留量的测定。方法检测限为001 mgkg，定量限为005 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条
3、款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样GBT 20195动物饲料试样的制备3原理饲料经盐酸甲醇混合溶液提取、醋酸铅沉淀蛋白后用固相萃取小柱净化，洗脱液蒸干后用含02甲酸的水溶液溶解，供液相色谱串联质谱仪进行检测，外标法定量。4试剂和材料除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GBT 6682中一级水的规定。4 1甲醇
4、：色谱纯。42甲酸：色谱纯。4 3盐酸。4 4氨水。4 5醋酸铅。4 6盐酸甲醇提取液：取O1too|L盐酸80mL，加入甲醇20mL混匀。4 7饱和醋酸铅溶液：在50 mL水中加入一定量的醋酸铅，超声5 mln，直至固体不再溶解。4 8 02甲酸水溶液：取甲酸l mL，加水定容至500 mL。4 9 5氨水甲醇溶液：取5 mL氨水与95 mI。甲醇混合。410克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、克仑普罗、班布特罗、妥布特罗等13种对照品：纯度98。4 11口受体激动剂贮备液配制：分别精密称取13种p一受体激动剂类药物对照品，用
5、甲醇配成13份浓度各约为1 mgmL的标准贮备液，28冷藏保存，有效期6个月。412混合对照品T作液：分别吸取13种0一受体激动剂贮备液，置于一棕色容量瓶中，用02甲酸水1农业部1063号公告一62008溶液稀释成浓度为1“gmI，的对照品工作液。28冷藏保存，有效期1个月。4 13固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱，3 mE60 mg，或其他性能类似的小柱。4 14氮气：纯度9999。5仪器和设备5 1液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾电离源。5 2旋转蒸发仪。5 3离心机：转速大于7 OOO rmin。5 4粉碎机。5 5旋涡振荡器。5 6滤膜：022“m，水系。5 7天平：感量为0000I
6、g和001 g各一台。6试样制备按GBT 146991采样。选取有代表性饲料样品至少500 g，按6BT 20195制备试样。7分析步骤7 1提取称取2 g(精确至001 g)试样(6)于50mL离心管中，准确加入19mL盐酸甲醇提取液(46)和1 mL饱和醋酸铅溶液(47)，充分振荡20 min，然后于7 000 rrain离心10 min，上清液备用。7 2净化固相萃取小柱先用3mL甲醇、3mL水活化。取上清液(71)5mL过柱，用2mL水和2mL甲醇淋洗，空气抽干2 min，用5氨水甲醇溶液(49)5 mL洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发(40)至干，用1-o mL02甲酸水溶液(48)溶解，
7、过022 pm滤膜后上机测定。若样品液中含有的p受体激动剂浓度超出线性范围，进样前可用一定体积的流动相稀释，使稀释后上机液的p一受体激动剂浓度在线性范围内。8液相色谱一串联质谱测定8 1液相色谱条件a)色谱柱：C18(IOO minx 21 mm，粒径17 pm)，或其他效果等同的c18柱；b)柱温：40；c)进样量：5 gL；d)流动相：甲醇：02甲酸溶液一50：50；e)流速：02 mEmin。8 2质谱条件a)离子源：电喷雾正离子源；b)检测方式：多反应监测(MRM)；c)脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；d)毛细管电压
8、、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度；e)定性离子对、定量离子对及对应的保留时间、锥孔电压和碰撞能量见表1。农业部t063号公告62008表1 13种B一受体激动剂的定性、定量离子对及保留时间、锥孔电压、碰撞电压的参考值定性离子对 定量离子对 保留时间 锥孔电压 碰撞能量被测物名称V eV西马特罗 220 12021 1022012021 1 24 16(Cimater01) 22011601 16马布特罗 31112371 16311 1二237 1 178 26(Mabuter01) 3111)2171 25西布特罗 234 2162 0 1623421620126 23(Cim
9、buter01) 234 22162 10溴布特罗 3670；293 0 19367 02930 1 72 25(BrombuteroI) 36703490 12莱克多巴胺 30241644 173024i644133 26(Ractopamine) 302 d：2844 13氯丙那林 214O1541 17214021541 158 25(C10r口renalIne) 214 01961 12特布他林 226 31523 1722631523 124 25(Terbutaline) 22631703 12齐帕特罗 2623：2443 132623；2443 124 24(Zilpater01
10、) 26231853 24沙丁胺醇 240 3148 3 20240 3】483 l_25 22(Salbutam01) 24032223 10克仑特罗 27702030 172770；2030 155 25(Clenbuter01) 277 0259 0 11克仑普罗 26282449 1426282449143 19(Clenproper01) 2628；202 8 16妥布特罗 22781537 14227815371 77 19(Tulobuter01) 22781717 9班布特罗 3679717 303679_=2940 169 25(13ambuter01) 367 9294 0
11、 1783定性测定每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与混合对照品工作液中对应的保留时间偏差在25之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的对照品T作液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对离子丰度， 50 2050 10-20 10I允许的最大偏差， +20 土25 土30 508 4定量测定在仪器最佳工作条件下，对混合对照品工作液进样，以标准溶液中被测组分峰而积为纵坐标，被测组分浓度为横坐标绘制T作曲线，用丁作曲线对样
12、品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。上述色谱和质谱条件下，克仑特罗等13种B受体激动剂对照品的多反应监测(MRM)色谱图参见附录A。8 5平行试验按上述步骤，对同一样品进行平行试验测定。8 6回收率试验3农业部1063号公告一62008本标准线性工作范围为：1”gL50”gL。空白饲料样品中添加对照品T作液，按样品制备步骤操作，测定后计算样品添加的回收率。在005mgkg10mgkg浓度范围内的添加回收率为8020。9计算算试样中每种口一受体激动剂的含量以质量分数x计，数值以毫克每千克(mgkg)表示，按式(1)计 x一裟n式中：m-试样中某监测离子对的色谱峰对应的
13、p受体激动剂的质量，单位为微克(“g)m试样质量，单位为克(g)；n稀释倍数。10重复性在同一实验室由同一操作人员完成的两个平行测定的相对偏差不大于20。农业部1063号公告62008附录A(资料性附录)克仑特罗等13种P一受体激动剂的液相色谱一串联质谱图(MRM色谱图)1 溴布特罗2班布特罗3妥布特罗4 西马特罗5西布特罗6 克仑特罗7 克仑普罗ES+59 745e5絮80519“d_10_4 1斧 10RM of 1 C2h6a2n8ne1244ES+97慧一 !罂L一1“5”0 50 100 1 50 200 2 500 50 1 00 1 50 2 00 2 50beta080519
14、sfd_10_4 133 5：MRM of 1 Channel ES+1roi0 九 9111693。85”O 50 100 l 50 2 00 2500 50 1 00 1 50 2 00 2 508氯丙那林；9马布特罗；10 沙丁胺醇；11 莱克多巴胺12特布他林；13齐帕特罗。(8受体激动剂的浓度为10gI一)图A 1克仑特罗等13种P一受体激动剂对照品的MRM色谱图器；8器嚼”=鼍一噌甄。一M_ML_撇吕眦一9十28十贬wAr一一二二 碧m|8强1札丽螂一嬲。剐庐撼裟一一一呲一一轧雹一附一|8疆虬I。!耋一寸麓嗡一一时一王ML_腿|吕一如苎(=二i捧r弋札耋娜一雠易一霉一d五肼一吕常H坊|8j1m一。|耋一脚叩翠
