1、ICS 65120B 46中华人民 共禾口 国国家标准农业部1068号公告一32008饲料中1 0种蛋白同化激素的测定液相色谱一串联质谱法Determination of ten kinds of anabolic androgenic steroids in feedsHigh performance liquid chromatography tandem mass spectrometry20080725发布 20080725实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部1 068号公告一32008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化
2、技术委员会归口。本标准主要起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心(北京)、浙江省饲料监察所、北京市饲料监察所、上海市兽药饲料检测所。本标准主要起草人：赵根龙、苏晓鸥、朱聪英、应永飞、苏淑清、韦敏珏、黄士新、索德成、邓程君、卢光菊、曹莹。农业部1 068号公告一32008饲料中10种蛋白同化激素的测定液相色谱一串联质谱法1范围本标准规定了用高效液相色谱一串联质谱法测定配合饲料中大力补、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、睾酮、诺龙、丙酸诺龙、勃地龙、群勃龙、脱氢异雄酮、黄体酮等10种蛋白同化激素含量的方法。本标准适用于配合饲料中大力补等10种蛋白同化激素含量的测定。方法最
3、低定量限为o05 ragkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注Et期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 20195动物饲料试样的制备3方法提要饲料样品中的蛋白同化激素以甲醇溶液超声提取，提取液离心后经C。s固相萃取柱净化，以甲醇洗脱，用高效液相色谱串联质谱仪，电喷雾正离子方式进行测定。4试剂除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GBT 6
4、682中二级水的规定。4 1甲醇：色谱纯。42甲酸：色谱纯。4 3乙腈：色谱纯。4 4甲醇溶液I：分别用量筒量取300 mL甲醇(41)和700 mL水，混匀。45甲醇溶液：分别用量筒量取200 mL甲醇(41)和800 mL水，混匀。4 6大力补、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、睾酮、诺龙、丙酸诺龙、勃地龙、群勃龙、脱氢异雄酮、黄体酮等10种蛋白同化激素对照品：纯度98。4 7蛋白同化激素贮备液配制：分别精密称取10种蛋白同化激素对照品至棕色容量瓶中，用甲醇配成10份浓度各约为1 mgmL的标准贮备液，-20 OC保存，有效期6个月。4 8混合对照品丁作液：分别吸取一定量的lO种蛋白同化激素类药物的贮
5、备液(47)，置于棕色容量瓶中，用甲醇稀释成浓度为100 ngmL、500 ngmL、1000 ngmL、5000 ngmL、i0000 ngmL、500ngmI的对照品T作液。 20保存，有效期1个月。4 9固相萃取小柱：C，。固相萃取柱，载体200rag；承载液体积3mL，或其他性能类似的小柱。5仪器和设备51实验室常用仪器、设备。农业部1068号公告一3200852分析天平：感量为00001 g和0001 g各1台。5 3超声水浴。5 4离心机：4 000 rmin5 000 rmin(相对离心力为1 912 g2 988 g)。55固相萃取装置。5 6配备电喷雾离子源(ESI)的液相色
6、谱串联质谱仪。57可控温3050氮吹装置。6试样制备按照GBT 20195制备样品，全部通过028mmfL筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存，备用。7操作方法71提取称取饲料样品5 g(准确至0001 g)，置于i00 mL离心管中，准确加入甲醇溶液T(44)50oo mL，加塞，充分摇动1rain，再置超声水浴中超声提取20rain，其间充分摇动2次。取出后，于离心机上5 000rmin离心10 rain。7 2净化分别用3mL甲醇、3mL水活化固相萃取小柱(49)，准确移取lomL上清液(7I)上柱，控制过柱速度在ImLmin以内。再用3mL水和3mL甲醇溶液(45)洗涤固相萃取柱，近
7、干后用甲醇(41)5mL洗脱。在氮吹装置(57)上40。C下用氮气吹干。准确加入一定体积的甲醇(41)，涡旋振荡1min，过045m滤膜，上机测定。7 3测定7 3 1液相色谱串联质谱条件色谱柱：C。柱，柱长150 mm，柱内径21 mm，粒度35“m或性能类似的分析柱。柱温：室温。流动相流速：250 uLmin。进样量：20“L。流动相、流速及梯度洗脱条件见表l(实际根据使用仪器及色谱柱适当调整)。表1 流动相、流速及梯度洗脱条件时间，rain 流速，mLrain 01甲酸溶液， 乙腈，0 O 025 50 50150 O25 10 90190 O 25 10 9020O 025 50 50
8、7 3 2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源。b)扫描方式：正离子模式。c)检测方式：多反应监测。d)壳气流量、补充气和碰撞气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。e)毛细管温度、棱镜补偿、碰撞能量等值应优化至最佳灵敏度。f)定性离子对、定量离子对及对应的保留时间和碰撞能量参考值见表2。2农业部1068号公告一32008表2 10种蛋白同化激素的定性、定量离子对及保留时间、碰撞电压的参考值定性离子对 定量离子对 参考保留时间 参考碰撞能量被测药物名称V27121992 28群勃龙 271O199 0 3 73271 22532 2328701351 22勃地龙287 1121 1
9、394287011211 322752109 l 38诺龙 2753109 1 43527522573 262893971 32睾酮 2893971 49828931091 3530131211 35大力补301_3121 1 4 52301 3283 2 163034972 40甲摹睾酮 30341091580303 4109 1 36289 02530 12脱氢异雄酮 28902130 499289O2130 20331 2109 1 34丙酸诺龙 331 4109 1 9 473312145 3 36345 2972 44丙酸睾酮34541091 126734521091 2831519
10、70 22黄体酮 315 197 0 13 79315 1109 0 227 3 3定性测定每种被测组分选择1个母离子、2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时问与混合对照品T作液中对应的保留时间偏差在5之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近对照品工作液中对应的定性离子的相对丰度进行比较。若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差单位为相对离子丰度 50 2050 io20 10允许的最大偏差 土20 25 30 土507 3 4定量测定定量方法：在仪器最佳工作条件下，对混合对照品工作液进样，以标准溶液中
11、被测组分与样品中被测组分的峰而积进行单点或多点校正定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。8结果计算与表述81试样中某种蛋白同化激素的质量分数X，以毫克每千克(mgkg)表示，可用式(1)计算y一!丕!丕!丕兰!P“m X y2式中：P；试样溶液中某种蛋白同化激素的峰面积值；V，试样提取液体积，单位为毫升(mL)；G某种蛋白同化激素标准溶液浓度，单位为微克每毫升(pgmL)；Vz净化时分取溶液的体积，单位为毫升(mL)；农业部1068号公告一32008P。标准溶液峰面积平均值；m试样质量，单位为克(g)；U上机前定容体积，单位为毫升(mL)。8 2结果表示平行测定结果用算术平
12、均值表示，保留3位有效数字。9重复性在同一实验室由同一操作人员完成的2个平行测定的相对偏差不大于20。农业部1 068号公告一32008附录A(资料性附录)10种蛋白同化激素的液相色谱一串联质谱图A 1 100 ngmLlO种蛋白同化激素标准液相色谱一串联质谱图见图A1。从上至下依次为：群勃龙、诺龙、勃地龙、脱氢异雄酮、睾酮、大力补、甲基睾酮、黄体酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮。D：LXcaliburuopbstd080604154831m_ 3,73 NL”6E5。j 061 1592、19 3“409 5786 38 7 53 7 97 963101010 6212 21 13 8714 7616
13、 3216 95t7 44 19 9625320】MSl00ppbstd080604154”l11 TICR+cSRMms2275 20一26J0109,10一j 1281 88 2 89“一|4 935736 54 818 8 7093010 341140 1317142415 0516 0616 87 1 8 3619 03 25730MSl00ppbsd_080604154831jlw J i 11CSRMms2287 00_2200121COi j o 69 170 303。4805296,07 735 8,709 2010 08 11 35 12 21 13 72 15 39 16
14、40175218 31 1992135001”oppbstd_080“”48”翔。：物，。s吼5麓2，螂卸。：。：。：。，埘。142T，IC删F：+c。SRMm228900-1200186900ppbstd_080604154831”i。k坐壁苎：坠芷塑：盛型!竺型!型型幽幽!：竺幽坐!业zs删一”499 NLl 74E5j 072 155 275 3 48 395 587631 735 847 94910 27 11 72 1344 144815 7116 20 18 39 195610911MSl00ppbstd_080604154831Timehnin)RT：O(K卜20 01100 4
15、i2 。NL。：4，7+9。E。5。：。一：00【。j 1191 87267 3 823 579 715 777 840 95910 4011，4712 3512 8214 59 16 3617 01 19 0419 85283删MSlOOppbtd_080604154831，#丐孕：黑。：。删一8j 091 192 291 442 530 j6136 89 856 9,02 10 5811 39 12 8713 5814 8315 63167517 43 18 83 10891MSl00ppbstd08”4154831j”百鬲-I2 36E511叼 ：952TIC h SRM2315 103
16、ZOO97_(10i o l 352 3 4 5 77 6 7 14 17 11】”1”ppb“80“4”10t68 26 30 32 71 75 845 98010 8712 28 02 15 3015 76 72 1 8 81自V鬲焉1L：333E4i1 TICn+c SRMals233120一360010910一4050l 332 08263 4 815 67 7 08 8 01 9 299 88 11,161246ir1129314 6715 53160316,941 84519 5414530IMSlOOop。”d 080似1548”P了3。179LI 45E5100q 13 71 TIC n+c SRM m234520一320019719一j o 76 l 69 299 3m 4 63 5785,70 7 868 64 10 2811 Ol 12 72 1400 1566168417 54 1 8 95”MSl00ppb8d_080“4”10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Timeminl图A 1 100 ngmLl0种蛋白同化激素标准液相色谱一串联质谱图
