1、ICS 65120B 46中华人民共和国国家标准20080725发布农业部1068号公告一62008饲料中雷洛西芬的测定高效液相色谱法Determination of raloxifene in feedsHigh-performance liquid chromatography20080725实施中华人民共和国农业部发布刖 置农业部1 068号公告一62008本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提山。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心(济南)、中国农业科学院饲料研究所、河北省饲料监察所。本标准主要起草人：
2、李俊玲、李桂华、宫玲玲、孙延军、门晓冬、刘庆生、刘继明、杨志强、李文香、张萍、陈宝明。饲料中雷洛西芬的测定高效液相色谱法农业部1068号公告一620081范围本标准规定了配合饲料中雷洛西芬的高效液相色谱测定方法。本标准适用于配合饲料中雷洛西芬的测定。方法检测限为005 mgkg，定量限为05 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室
3、用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样GBT 20195动物饲料试样的制备3方法原理配合饲料用甲醇提取，上清液用固相萃取小柱净化，洗脱液蒸干后用流动相溶解，在高效液相色谱仪上分离、测定，外标法定量。4试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水符合GBT 6682一级水的规定。4 1甲醇；色谱纯。4 2乙腈：色谱纯。4 3氨水。4 4甲醇。4 5乙酸铵。46冰乙酸：优级纯。4 7 5氨水甲醇溶液：取5mL氨水与95mL甲醇混合。4 8乙酸铵溶液：c(CH。C(X)NH4)一o05 moUL。称取385 g的乙酸铵，加水约950 mL溶解，用冰乙酸调pH至40-0
4、1，再用水定容至1 000mL。用前过045“m无机滤膜。4 9流动相：乙腈+乙酸铵溶液一33+67。4 10雷洛西芬对照品：纯度98。411雷洛西芬贮备液：准确称取雷洛西芬对照品25mg，用甲醇(41)溶解，定容至25mL，配成浓度为1 mgmL的标准贮备液。2。C8冷藏保存，有效期6个月。4 12标准工作液：准确移取雷洛西芬贮备液(411)5 mL用甲醇(41)定容至50 mL，该溶液浓度为100 pgmL。取此溶液适量逐步稀释，用甲醇(41)定容，配制成浓度分别为01 pgmL、02 pgmL、05 pgmL、10 pgmL、20 pgmI5 0 pgmI。、100”gmL的标准工作曲线
5、。2。C8冷藏保存，有效期1周。农业部1068号公告一620084 13固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱，3 mL(60 mg)。或其他性能类似的小柱。414滤膜：022 p,m和045 pm。5仪器和设备5 1 高效液相色谱仪：配有紫外检测器和二极管阵列检测器。5 2天平：感量为0000l g。5 3离心机：转速大于4 000 rmin。5 4粉碎机。5 5旋涡振荡器。56固相萃取装置。5 7旋转蒸发仪。5 8氮吹仪。5 9酸度计。6试样制备按OBT 146991采样。选取有代表性饲料样品至少500 g，按GBT 20195制备样品。7分析步骤7 1提取称取试料5 g(精确至0000 1 g
6、)于i00 mL离心管中，准确加入50 mL甲醇(44)，旋涡振荡2 rain，然后于4 000 rrain离心10 rain，上清液备用。7 2净化固相萃取小柱分别用2mL甲D(41)、2mL水活化。取上清液(71)5mL过柱，再分别用3mL水、3mL甲醇(41)淋洗，空气抽干2rain，用5氨水甲醇溶液(47)3mL洗脱，收集洗脱液，40。c氮吹至干，准确移取2mL流动相(49)溶解残渣，过022ffm滤膜后待测。7 3液相色谱条件色谱柱：C。250 minX46 mm，粒径5 pm。或其他效果等同的cs柱。柱温：室温。进样量：20“L。流动相：乙腈+乙酸铵溶液-33-67。检测器：紫外检
7、测器和二极管阵列检测器。检测波长：289 nm。流速：10 mLrain。7 4定性测定除保留时间定性外，还需用二极管阵列检测器测定雷洛西芬的紫外区特征光谱图，在289 nm有最大吸收峰。75定量测定用紫外检测器测定标准系列(从低浓度到高浓度)和试料溶液(72)中雷洛西芬峰面积的响应值，用单点或多点校准法进行定量。8结果计算饲料中雷洛西芬的含量以质量分数x计，数值以毫克每千克(mgkg)表示，按式(1)计算：农业部1068号公告62008x一等等州，式中：c试料色谱峰面积对应的雷洛西芬的浓度，单位为微克每毫升(pgmL)；V加入提取液的总体积，单位为毫升(mL)；U氮吹至干后溶解残渣用流动相的
8、体积，单位为毫升(mL)；m试料的质量，单位为克(g)；V，移取过固相萃取小柱的试液体积，单位为毫升(mL)。计算结果保留3位有效数字。9重复性在同一实验室、由同一操作人员完成的2个平行测定结果，相对偏差不大于10，以2次平行测定结果的算术平均值为测定结果。农业部1 068号公告一62008附录A(资料性附录)雷洛西芬特征光谱图和标准样品谱图A 1雷洛西芬的二极管阵列特征光谱图见图A1。mAU42O一24200 225 250 275 300 325 350 375 nm图A 1 雷洛西芬的二极管阵列特征光谱图A 2雷洛西芬的标准样品图谱见图A2。O图A 2雷洛西芬的标准样品图谱(浓度为0 1lgmL)删，嘶呲。m州
