1、ICS 6502001B 04中华人民共和国国家标准农业部1193号公告一12009转基因植物及其产品成分检测耐贮藏番茄D2及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived productsQuafitative PCR method for ripen-delay tomato D2 and its derivates20090423发布 20090423实施中华人民共和国农业部发布刖 罱本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部科
2、技发展中心、上海交通大学。本标准主要起草人：杨立桃、沈平、张大兵、宋贵文、李想。农业部1 193号公告一120091范围农业部1 193号公告一12009转基因植物及其产品成分检测耐贮藏番茄D2及其衍生品种定性PCR方法本标准规定了转基因耐贮藏番茄D2转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因耐贮藏番茄D2及其衍生品种，以及制品中D2的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单Og包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的
3、引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1LAl52基因LAT52 gene编码富含半胱氨酸蛋白的基因，在番茄花粉中特异性表达。3 2D2转化体特异性序列event-specific sequence of 1)2外源插入片段3L端与番茄基因组的连接区序列，包括外源插入载体3端NOS终止子序列和番茄基因组的部分序列。4原理根据转基因耐贮藏番茄D2转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期22
4、8 bp的特异性DNA片段，判断样品中是否含有D2转化体成分。5试剂和材料使用分析纯试剂和重蒸馏水。5 1琼脂糖。5 2 10 gL溴化乙锭溶液：称取10 g溴化乙锭(EB)，溶于100mL水中。注：演化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5 3 10molL氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠(NaOH)800 g，先用t50mL水溶解后，再加水定容到200mL。5 4 500 rmnoIL乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8o)：称取186 g乙二铵四乙酸二钠(EDTANa2)，加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液(53)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(53)
5、1调pH至80，加水定容至100 mL。在1034 kPa(121。C)条件下灭菌20 min。55 1 toolL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH 8o)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8o，加水定容至1 000mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20min。5 6 TE缓冲液(pH 8o)：分别量取lO mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，加水定容至1 000mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20rain。57 50TAE缓冲液：称取2422 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，先用3
6、00mL水加热搅拌溶解后，加入100 mI乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容到1 000 mL。使用时用水稀释成1TAE。58加样缓冲液：称取2500mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12 h；称取2500mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取500 g蔗糖，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4下保存。5 9 DNA分子量标准：可以清楚的区分50 bpl 000 bp的DNA片段。510 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmolL的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。511 Taq DNA聚合酶(5
7、 U“L)及PCR反应缓冲液。5 12引物。5 12 12752基因LATF：5AGACCACGAGAACGATATTTGC一3LAT R 1 5，_TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA 3预期扩增片段大小为92 bp。5122 D2转化体特异性序列HF F5一CTGTTGCCCGTCTCACTG 3HFR：5 7 AATCGTGTATGACCTTTTAG一3预期扩增片段大小为228 bp。5，13引物溶液用TE缓冲液(56)分别将上述引物稀释到10,umolL。514石蜡油。515 PCR产物回收试剂盒。6仪器61分析天平，感量01mg。62 PCR扩增仪。6 3电泳槽、电泳仪等
8、电泳装置。6 4紫外透射仪。65凝胶成像系统或照相系统。5。6重蒸馏水发生器或超纯水仪。6 7其他相关仪器设备。7操作步骤71抽样按NYT 672和NYT 673规定执行。Z72制样按NYT 672和NYT 673规定执行。73试样预处理按NYT 674规定执行。7 4 DNA模板制备按NYT 674规定执行。75 PCR反应7 51试样PCR反应75 1 1每个试样PCR反应设置3次重复。7512在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50弘L石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。7513将PCR管放入台式离心机中离心3_o s后插入PCR仪中。7514运行PCR反应。反
9、应程序为：95。C变性7rain；94。C变性30 s，56 0C退火30 s，72C延伸30 s，共进行35次循环；72延伸7 min。7 515反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1 PCR检测反应体系试 剂 终浓度 体 积重蒸馏水 3175 uLlOXPCR缓冲渡 l 5 vL25 retoolL氯化镁溶液 25retoolI。 5 p-LdNTPs 02mmoI1 1 pL10 vtmolL E游引物 05 pmolL 25 pL10molL F游引物 05znolL 25 uL5 UwLTaq酶 0025unL 025 nL25 mgL DNA模板 1mgI
10、20 eL总体积 50 uL洼1：如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积重蒸馏水。注2；番茄内标准基因PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为LATF和LATR；转基因番茄D2转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为HFF和HFR。752对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因番茄材料中提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板；以转基因番茄D2DNA含量为011O的番茄DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板；空白对照中用重蒸馏水代替PCR反应体系模板。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与751相同。
11、7 6 PCR产物电泳检测按20 gL的浓度称取琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5“L EB溶液，混匀，适当冷却后，将其倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放人1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7牡LPCR产物与3pL加样缓冲液混合后加入点样iL中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2Vcm5vcm条件下电泳。7 7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8农业
12、部1 193号公告一1-2009的规定对PCR扩增结果进行分析。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照78和79的规定执行。78 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。79 PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述81对照检测结果分析阳性对照PCR反应中，LAT52内标准基因和D2转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出LAT52基因片段，空白对照中除引物二聚体外，没有其他扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。8
13、2样品检测结果分析和表述a)LAT52内标准基因和D2转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出转基因耐贮藏番茄D2，表述为“样品中检测出转基因耐贮藏番茄D2转化体成分，检测结果为阳性”。b)LAT52内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而D2转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表盟试样中未检测出转基因耐贮藏番茄D2，表述为“样品中未检测出转基因耐贮藏番茄D2转化体成分，检测结果为阴性”。c)LAT52内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出番茄成分，表述为“样品中未检测出番茄成分，检测结果为阴性”。
