1、ICS 6502001B 04中华 人民共和 国国家标准农业部1193号公告一22009转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Topasl 92及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and delved productsQualitative PCR method for herbicide-tolerant rapeseed Topas 1 92and its derivates2009-0423发布 2009-0423实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部1 193号公告一2-2009本标准由中华人民共和国农业部科技教
2、育司提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所。本标准主要起草人：卢长明、刘信、武玉花、吴刚、雷绍荣、肖玲、厉建萌。1范围农业部1 193号公告一：)_2009转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Topas 1 912及其衍生品种定性PCR方法本标准规定了转基因耐除草剂油菜Topas 192转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因耐除草剂油菜Topas 192及其衍生品种，以及制品中Topas 192的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明El期
3、的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1HMGlv基因HMGIl，gene编码高移动簇蛋白IY(High Mobile Group Protein IY)的基因。32Topas 1912转化体特异性序列event-specific sequence of Topa
4、s 192Topas 192外源插入片段3L端与油菜基因组的连接区序列，包括Nos启动子5L端部分序列和油菜基因组的部分序列。4原理根据耐除草剂油菜Topas 192转化体特异性序列设计特异性引物，对试样DNA进行PCR扩增。依据是否扩增获得110 bp的预期DNA片段，判断样品中是否含有Topasl92转化体成分。5试剂和材料使用分析纯试剂和重蒸馏水。5 1琼脂糖。5 2 109L溴化乙锭溶液：称取10 g溴化乙锭(EB)，溶解于lOOmL水中。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。53 10toolL氢氧化钠溶液：称取800 g氢氧化钠(NaOH)，加160mL
5、水溶解后，再加水定容到200mL。54 500retoolL乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8o)：称取186 g乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2)，加1农业部1 193号公告22009人70 mI。水中，JIA适量氢氧化钠溶液(53)，加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液(53)调pH至80，用水定容到100 mL。在1034 kPa(121。C)条件下灭菌20 rain。55 1 toolL三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(pH 80)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Trls)溶解于800 mL水中，用盐酸(Hcl)调pH至8o，加水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121。C)条
6、件下灭菌20min。56 TE缓冲液(pH 8o)：分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)溶液，加水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121。C)条件下灭菌20 min。57 50TAE缓冲液：称取24229三羟甲基氨基甲烷，加入300mL水加热搅拌溶解后，加入100 rnLL-铵四乙酸二钠溶液(54)，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容到1 000 rnL。使用时用水稀释成1TAE。58如样缓冲渡：称取250，0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12 h；称取2500mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取500 g蔗糖，加30
7、mL水溶解。混合三种溶液，加水定容至100mL，在4下保存备用。59 DNA分子量标准：可以清楚的区分50 bp1 000 bp的DNA片段。510 dNTPs混合溶液：将浓度为10 retoolL的dATP、dlvrP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5”Taq DNA聚合酶(5 u扯L)及PCR反应缓冲液。512引物。512 1MGlr基因HMGF：5 7一TCCTTCCGTTTCCTCGCC一37HMGR：5一TTCCACGCZCTCTCCGCT一3预期扩增片段大小为206 bp。5 12 2 T坤192转化体特异性序列TopasF：5一AGTTCCAAACGTAAAAC
8、GGCTT一3TopasR：5一CGGCCTTAATCCCACCCCAG一3预期扩增片段大小为110 bp。513引物溶液用TE缓冲液(56)分别将上述引物稀释到10#molL。514 PCR产物回收试剂盒。6仪器6 1重蒸馏水发生器或超纯水仪。6 2 PCR扩增仪：升降温速度15s，孔间温度差异l，带有防蒸发热盖。63电泳槽、电泳仪等电泳装置。64紫外透射仪。65凝胶成像系统或照相系统。66分析天平。感量o1mg。67其他相关仪器设备。7操作步骤71抽样2按NYT 672和NYT 673规定执行。72制样按NYT 672和NYT 673规定执行。73试样预处理按NYT 674规定执行。7 4
9、 DNA模板制备按NYT 674规定执行。75 PCR反应7 51试样PCR反应7511每个试样PCR反应设置3次重复。751 2在PcR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀。7 513将PCR管在台式离心机上离心10 s后插入PCR仪中。7 5 1 4进行PCR反应。反应程序为：94变性5 min；94。C变性30 s，60退火30 s，72延伸30 s共进行35次循环；72延伸7 rain。7 51 5反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1 PCR反应体系试 剂 终浓度 体 积重蒸馏水 3425LloRCR缓冲液 1 5,uL25 mmolL氯化镁溶液 2
10、5mmolL 5 pL10 mmolL dNTPs混合溶液 02mmolL 1 uL10“molI。上游引物 025,umolL 125 uI。10“molL下游引物 025 umolL 125“L5UpLTaq酶 0025UuL 025“L25 mgL DNA模板 lmgL 20,uL总体积 50“I。注1：如果10PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积重蒸馏水。注2：油菜内标准基因PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为HMG-F和HMG-R；Topas 192转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为Topas_F和TopasR。7 5 2对照PCR反应在试样PCR反应
11、的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因油菜材料提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板；以耐除草剂油菜Topas 192含量为0110的油菜基因组DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板；空白对照中用重蒸馏水代替PCR反应体系模板。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与751相同。7 6 PCR产物电泳检测按209L的浓度称量琼脂糖加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5“L EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放人1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7弘L PCR产物
12、与3 pL加样缓冲液混合后加人凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2 Vcm5 vn条件下电泳。77凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照农业部1 193号公告220098的规定对PCR扩增结果进行分析。如需通过序列分析确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照78和79的规定执行。78 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。7 9 PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，确
13、定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述81对照检测结果分析阳性对照的PCR反应中，HMG Jy内标准基因和Topas 192转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出HMGIY基因片段，空白对照中除引物二聚体外没有其他扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。82样品检测结果分析和表述a)HMG jy内标准基因和Topas 192转化体特异性序列均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检出转基因耐除草剂油菜Topas 192，表述为“样品中检测出转基因耐除草剂油菜Topas 192转化体成分，检测结果为阳性”。b)HMGIY内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而Topas 192转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检出耐除草剂油菜Topas 192，表述为“样品中未检测出耐除草剂油菜Topas 192转化体成分，检测结果为阴性”。c)HMG Jy内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出甘蓝型油菜成分，表述为“样品中未检测出甘蓝型油菜成分，检测结果为阴性”。4
