1、ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准农业部1486号公告一3一2010饲料中安普霉素的测定高效液相色谱法2010-11-16发布Determination of Apramycin in feeds High performance liquid chromatography 2010-11-16实施1: 中华人民共和国农业部发布前言本标准遵照GB/T 1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。本标准负责起草单位:中国农业大学、农业部饲料工业中心。本标准起草人:张丽英、下.宗义、常
2、碧影、杨文军、贺平丽。农业部1486号公告一3-2010I 范围饲料中安普霉素的测定高效液相色谱法本标准规定了测定饲料中安普莓素的高效液相色谱法。农业部1486号公告一3一2010本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中安普霉素的测定。方法检:11限和定量限分别为3mg/kg和10mg/峙。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/ T 14699. 1饲料采样3 方法原理饲料中的安普莓素用盐酸溶液提
3、取，经阳离子固相萃取柱净化后，以邻苯二甲醒衍生，然后用高效液相色谱分离和荧光检测器检测，以外标法进行定量。4 试剂和材料除特殊注明外，本标准所用的试剂均为分析纯。水为去离子水，符合GB/T6682二级用水的规定。4. 1 元水甲醇。4. 2 氨水，25%。4. 3 浓盐酸。4.4 盐酸榕液c(HCD二O.10 mol/ L:准确量取8.4mL浓盐酸(4.3)，用水稀释至1000mL。4.5 氨水甲醇溶液:量取20mL甲醇(4.1)于100mL容量瓶中，加人5.00mL氨水(4.2)，然后用甲醇(4.1)定容至刻度。4. 6 氢氧化纳溶液c(NaOH)=6 mol/ L: 240 g氢氧化铀溶解
4、于1000mL水中。4. 7 珊酸盐缓冲榕液:准确称取24.73g棚酸于1000mL烧杯中，用约900mL水榕解，然后用氢氧化铀榕液(4.的调pH至9.5，并用水定容至刻度。4. 8 衍生试剂:准确称取0.134g邻苯二甲醒(OPA)于25mL棕色容量瓶中，依次加5mL甲醇、100L2 -琉基乙醇，混合榕解，并用棚酸盐缓冲榕液(4.7)定容至刻度。4.9 安普霉素标准溶液4.9. 1 安普霉素标准贮备液:准确称取安普霉素标准品(含量二三99%)0.0250g，置于25mL容量瓶中，用水榕解，并稀释至刻度，摇匀，其浓度为1mg/mLo 40C条件下贮藏，有效期1个月。4.9.2 安普霉素标准中间
5、液:分别准确吸取标准贮备液(4.9.1)10.00mL，置于100mL容量瓶中，用水稀释、定容，其对应的浓度为100g/mL。4.9.3 安普霉素标准工作液:取安普霉素标准中间液(4.9.2)2.50mL、1.25 mL、0.500mL、0.250mL 和0.125mL分别于25.0mL容量瓶中，用棚酸盐缓冲液(4.7)稀释至刻度，摇匀，其浓度分别为10.0农业部1486号公告一3-2010g/mL、5.00g/mL、2.00g/mL、1.00g/mL和O.500g/mL。4. 10 流动相A:称取0.77g乙酸股于1000mL容量瓶中，加水约800mL，待其溶解后，加乙酸40mL，并用水稀释
6、至刻度，摇匀。4. 11 流动相B.乙睛，色谱纯。4. 12 具有反相与阳离子交换双重保留机制的泪合型固相萃取小柱。5 仪器、设备5. 1 分析天平:感量为0.0001g。5. 2 磁力搅拌器。5. 3 离心机:能达3000r/ min4 000 r/ min。5.4 固相萃取装置。5.5 恒温水浴锅。5. 6 氮气吹干仪。5. 7 高效液相色谱仪(配有荧光检测器)。6 试样制备按GB/T14699.1采取有代表性的样品1000g，用四分法缩减至约200g，粉碎，使全部通过O.45 mm孔径的筛，混匀，贮存于磨口瓶中备用。7 分析步骤7. 1 提取称取适量试样(配合饲料5g，浓缩饲料2g3 g
7、，添加剂预混合饲料1g，准确至0.0001 g)置于50mL离心管中，加盐酸榕液(4.4)40mL, 盖好盖，置于磁力搅拌器上搅拌提取25min，于离心机上3000r/ min4 000 r/ min离心10min。上清液转移至100mL容量瓶中，再分别用35mL、25mL盐酸溶液(4.4)提取两次，汇集上清液，并用盐酸榕液(4.的稀释至刻度，摇匀，用中速定量滤纸过滤，滤液备用。浓缩饲料和添加剂预混合饲料上述滤液需要分别做5倍和10倍稀释。7.2 净化分别用1.0 mL甲醇(4.1)和1.0 mL JJ活化固相萃取小柱(4.12)，然后准确加载1.00 mL样品提取液(7.1)于固相萃取小柱(
8、4.12)，并以不超过1.0 mL/min的流速过柱，然后分别用1.0 mL盐酸榕液(4.4)和1.OmL甲醇(4.1)各淋洗一次，用氨水甲醇溶液(4.3)洗脱至10mL试管中，然后置于600C水浴中，用氮气吹干。用1.00 mL棚酸盐缓冲液(4.7)榕解后，待上机测定。7. 3 测定7.3. 1 色谱条件色谱柱:C18柱，柱长300mm，内径3.9mm，粒度5m或性能类似的分析柱。柱温:室温。流动相:流动相A(4.11)十流动相B(4.12) = 1十lCv/v)，流速1.0 mL/min，洗脱时间15min。检测器:激发波长230nm，发射波长389nm。进样量:100L。7. 3. 2
9、衍生、上机准确移取样品榕液(7.2)400L置于高效液相色谱仪的进样瓶中，加人200L的衍生试剂(4.的，混合，控制衍生时间5.0min，立即进样，进行分离测定。农业部1486号公告-3-20107. 3. 3 标准曲线的制作准确移取安普霉素标准下半作液(4.9.3)400L，按照7.3.Z进行衍生、测定，并以标准工作液的浓度对峰面积绘制工作曲线。7.3.4 结果的计算与表述试样中安普霉素的含量，以质量分数(mg/kg)表示，按式(1)计算。式中:x=兰兰卫兰m X 试样中安普霉素的含量，单位为毫克每下克(mg/kg); V 制备最终用试样榕液的体积，单位为毫升(mL);m 试样质量，单位为克(g); 由T作曲线计算得III的上机试样溶液中安普霉素浓度，单位为微克每毫升(g/mL); 稀释倍数。测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留气位有效数字。8 允许差同一实验室同一操作人员完成的两个平行测定的相对偏差不大于15%。3
