1、ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准农业部1486号公告-4-2010饲料中硝基眯瞠类药物的测定液相色谱一质谱法Determination of nitroimidazoles in feeds一Liquid chromatography-mass spectrometry method 2010-11-16发布2010-11-16实施乌云、).，中华人民共和国农业部发布目。昌本标准遵照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。本标准由全同饲料工业标准化技术委员会CSACjTC76)归口。本标准起草单位:中同农业大学动物医学院。农业部
2、1486号公告-4-2010本标准起草人:沈建忠、张素霞、程林丽、肖希龙、王战辉、江海洋、李建成。农业部1486号公告-4-2010饲料中硝基眯睡类药物的测定液相色谱一质谱法范围本标准规定了饲料中硝基咪瞠类药物含量的液相色谱一质谱检测法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中甲硝睡、洛硝贴嗖、二甲硝瞠和替硝睡含量的测定。本方法的检测限:饲料中甲硝瞠、洛硝贴瞠、二甲硝略和替硝瞠均为15g/kg。本方法的定量限:饲料中甲硝略、洛硝贴瞠、二甲硝略和替硝哩均为50g/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期
3、的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法GB/ T 14699. 1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3 方法原理用乙酸乙醋提取试样中的硝基咪哩类药物，浓缩近干，用0.1mol/ L磷酸榕解，正己烧和MCX间相萃取柱净化。液相色谱一质谱法测定，外标法定量。4 试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的二级水。4.1 甲醇:色谱纯。4.2 乙酸乙醋。4. 3 正己烧。4. 4 磷酸。4.5 甲酸:色谱纯。4.6 MCX间相萃取柱:规格为60mg。4. 7 微孔滤膜:规格为O.2m。
4、4. 8 甲硝哗(Metronidazole):纯度二三98%。4. 9 洛硝贴瞠(Ronidazole):纯度注98%。4. 10 二甲硝瞠(Dimetridazole):纯度注98%。4. 11 替硝瞠(Tinidazole):纯度二三98%。4. 12 磷酸溶液(0.1mol/U:取3.4mL磷酸于1L容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。4. 13 间相萃取柱洗涤液:氨水+水十甲醇=0.2十10+0.204. 14 间相萃取柱洗脱液:氨水+水+甲醇=0.2十2+8。农业部1486号公告-4-20104. 15 硝基眯瞠类药物混合标准贮备液c1mg/mU:称取4种硝基眯哗类药物(4.8、4.9
5、、4.10、4.11)各0.1 g(精确到0.0001 g)于100mL容量瓶中，用乙睛济解定容。一200C保存3个月。4. 16 硝基咪略类药物混合标准贮备液(200g/mU:移取1mg/mL的混合标准贮备液(4.15)各2mL于10mL容量瓶中，用乙腊定容至刻度。40C保存1个月。4. 17 混合标准工作液:分别移取适量200g/mL混合标准贮备液(4.16)于100mL容量瓶中，用乙睛稀释定容，配制成0.01g/mL、0.05g/mL、0.1g/mL、O.5g/mL、lg/mL、5g/mL和10g/mL的标准t作液。40C保存l周。5 仪器和设备5. 1 实验室常用仪器、设备。5. 2
6、液相色谱质谱联用仪(LC-MS)，配电喷雾离子源。5. 3 分析天平:感量0.01g和感量0.0001g。5. 4 涡旋1昆合器。5. 5 离心机。5. 6 振荡器。5. 7 旋转蒸发仪。5. 8 间相萃取装置。6 采样与试样制备按GB/T14699. 1的规定采集样品后，按GB/T20195的规定取1kg样品，四分法缩减取约200g , 经粉碎，全部过0.45mm孔筛，11昆匀装人磨口瓶中备用。7 分析步骤7. 1 提取称取2gC精确至1j0.01g)试样于50mL离心管中，加15mL乙酸乙醋，涡动1min , 300 r/ min振荡30 mino 3 800 r / min离心10mi凡
7、取上清液于100mL鸡心瓶巾。fJ.二残渣用15mL乙酸乙醋在友提取一次。合并两次提取液。7. 2 净化将提取液于350C旋蒸浓缩至近卡，加300L乙酸乙醋，涡动10s，再加4mL正己烧，涡动30s，全部转移至10mL离心管中。往鸡心瓶中再加1.5 mL磷酸济液(4.13)，涡动1min，全部转移至同-离心管巾，于摇混合，6000r/min离心10mino吸取下层水相于5mL试管中，上层有机相用1.5 mL磷酸j容液(4.13)重复萃取一次，合并两次水相作为间相萃取上样液，备用。将MCX同相萃取柱安装F间相萃取装置上，依次用2mL乙腊、2mL磷酸洛液(4.13)活化。将备用液通过同相萃取柱，依
8、次用1mL磷酸溶液(4.13)、2mL i剖相萃取柱淋洗液(4.14)洗涤，抽真空1 mino 2 mL同相萃取柱洗脱液(4.15)洗脱。上样溶液和洗脱液的流速均控制在1mL/mi日以内。往洗脱液中加20L甲酸，混匀后500C氯气吹干，加2mL乙脂榕解，过O.2m滤膜，供液相色谱质谱测定。7. 3 测定7. 3. 1 液相色谱条件2 色谱柱:C18色谱柱，长150mm，内径2.1mm，粒径5m，或相当者。流动相:甲醇十水，梯度洗脱;梯度洗脱条件见表1。农业部1486号公告-4-2010流速:0.2mL/min。柱温:室温。进样量:10L。时间，ffiln。8 11 15 7.3.2 质谱条件正
9、离子扫描方式(ESI+)。毛细管电压:3.5kV。离子源温度:3500C。碰撞气:氧气。监测模式:选择离子监测。表1液相色谱梯度洗脱条件水，%80 80 。80 4种硝基咪瞠类药物的定性离子和定量离子见表2。表24种硝基眯瞠类药物的定性离子和定量离子名称洛硝贴吨甲硝吨持硝阳县二甲硝阳县7. 3. 3 液相色谱一质谱测定7.3.3. 1 定性测定定性离子m/z 223 , 140 ,55 172 ,128 ,82 248 ,12 1,93 142 , 96 ,81 甲醉，%20 20 100 20 :立址离子m/z 223 172 248 142 根据试样溶液中药物的含址，选择峰面积相近的标准r
10、作液和样品溶被军体积参插进样。通过液相色谱保留时间与质i普选择肖子共同定性。样MTrfT待测药物与标准物质的保留时间相对偏差不大于2.5%，而且，其选择离子的相对丰度的差异不大于10%04种药物的标准挥手液选择离子色谱罔见罔A. 1 7.3.3.2 定量测定分别取适量试样榕液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，试样液进样过程中应参插标准工作液，以便准确定量。8 结果计算饲料中硝基眯哇类药物的含量x，以质量分数(mg/kg)表示，按式(1)计算:CXVXn x=一一一一一一 (1) m 式中:C 试样液
11、中对应的硝基咪嗖类药物的浓度，单位为微克每毫升(g/mU;V一一试样液总体积，单位为毫升(mU; 稀释倍数;m一一试样质量，单位为克(g)。3 农业部1486号公告-4-2010测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留气位有效数字。9 精密度在重复性条件下完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于20%。4 Intens :-一X 105 l叮。:x 105: 。:x 10: 。一一X 105 2 O一农业部1486号公告-4-2010附录A(资料性附录)标准溶液选择离子色谱图0708140I.D:EICl72+All :vIS , Smootherl( 1.3 , 1, GA) 0708140I.D:EIC223+All :VI日，Smootherl(1.3, 1, GA) 0708140I.D:EICI42+All MS，自mootherl(1.3, 1 , GA) 0708140I.D:EIC248+All :VIS , SmoothrI( 1.3, 1, GA) 2 4 6 8 10 12 14 Tim,min 图A.15g/mL硝基眯瞠类药物标准溶液选择离子色谱图Cm/2223为洛硝il达l峪;m/z172为甲硝l吨;m/z248为将硝l吨;m/zI42为Fjl硝I岭)D
