1、ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准农业部1486号公告一5一2010饲料中阿维菌素类药物的测定液相色谱一质谱法Determination of avermectins in feeds一Liquid chromatography-mass spectrometry method 2010-11-16发布2010-11-16实施xji中华人民共和国农业部发布农业部1486号公告一5-2010前言本标准参考国际原子能组织兽药实验室分析化学组的有效标准操作程序SOPACU 0368肝组织中阿维菌素类药物的分析。本标准遵照GB/T1. 1二2009给出的规则起草。本标准由中华人民共
2、和国农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料t业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。本标准起草单位:中国农业大学动物医学院。本标准主要起草人:沈建忠、张素霞、程林丽、丁双阳、江海洋、主战辉、吴聪明。I 、良农业部1486号公告一5-2010饲料中阿维菌素类药物的测定夜相色谱一质谱法1 范围本标准规定了饲料中阿维菌素类药物的液相色谱-质谱检测方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素含量的测定。本方法的检测限:饲料中4种阿维菌素类药物均为10g/kg。本方法的定量限:饲料中4种阿维菌素类药物均为25g/kg。2 规范性引用文件下列文件对于
3、本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法GB/T 14699.1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3 方法原理用乙睛提取试样中的4种阿维菌素类药物，加水稀释，加气乙胶调节pH，经C18固相萃取柱净化，用液相色谱一质谱法测定，外标法定量。4 试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的二级水。4. 1 乙睛:色谱纯。4.2 正己皖。4.3 气乙股。4.4 甲酸:色谱纯。4.5 C18固相萃取柱:规
4、格为500rng。4.6 微孔滤膜:规格为0.2m。4. 7 埃普利诺菌素(Eprinorncctin):纯度注98%。4. 8 阿维菌素(Averrnectin):纯度二三98%。4. 9 多拉菌素(Dorarnectin):纯度二三94.3%。4. 10 伊维菌素(1verrncctin) :纯度注98%。4. 11 样品稀释液:水十气乙胶=30十0.045，V/V。4. 12 固相萃取柱洗涤液:乙睛十水+气乙胶二40十60+0.1。4. 13 阿维菌素类药物混合标准贮备液(1000g/rnL):分别称取0.05g(精确到0.0001g)埃普利诺菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品(4
5、.7、4.8、4.9、4.10)于50rnL容量瓶，用乙腊溶解定容。一200C保存3个月。农业部1486号公告一5一20104.14 阿维菌素类药物混合标准贮备液(100g/mL):取1000g/mL的阿维菌素类药物标准贮备液(4.13)10 mL于100mL容母瓶中，用乙睛稀释至刻度。40C保存1个月。4. 15 标准t作液:分别量取适量100g/mL阿维菌素类药物混合标准贮备液(4.14)，用乙睛稀释成浓度为0.025g/mL、O.05g/mL、0.1g/mL、O.5g/mL、1g/mL、5g/mL和20g/mL的系列标准t作液。40C保存1周。5 仪器5. 1 实验室常用仪器、设备。5.
6、2 液相色谱一质谱联用仪(LC/MS)，配电喷革离子源。5. 3 涡动仪。5.4 分析天平:感量0.01g和0.0001g。5.5 离心机。5. 6 固相萃取装置。5. 7 氮吹仪。6 采样与试样制备按GB/T14699. 1的规定采集样品后，按GB/T20195的规定取1kg样品，四分法缩减取约200g , 经粉碎，全部过0.42mm孔筛，7昆匀装入磨口瓶中备用。7 分析步骤7. 1 提取称取2g(精确到O.01 g)试样于50mL离心管中，加8mL乙睛，涡动0.5min, 3 500 r/min离心5mln，取上清液。残渣用8mL乙睛重复提取一次，离心，合并两次上清液。加30mL样品稀释液
7、(4.11) ，涡动j昆合均匀，作为固相萃取上样液备用。7. 2 净化取CIH罔相萃取柱，安装于间相萃取装置_t，依次用5mL乙腊、5mL 可相萃取柱洗涤液(4.12)活化。将固相萃取上样液过柱。用10mL固相萃取柱洗涤液(4.12)淋洗，抽真空2min;再用3mL正己烧淋洗，抽真空5mino 2 mL乙睛洗脱，收集洗脱液于5mL试管中。上样溶液和洗脱液的流速均控制在1mL/min以内。500C氯气吹干，加0.5mL乙睛榕解。过O.2m滤膜，供液相色谱一质谱仪分析。7. 3 测定7.3. 1 液相色谱条件色谱柱:C18柱，150mmX2.1 mm，粒径3m，或相当者。流动相:乙睛水十甲酸=70
8、+30十0.1。流速:0.2mL/mino 柱温:室温。进样量:10L。7.3.2 质谱条件2 离子化方式:电喷雾离子源，正离子扫描(ESI十)。毛细管电ffi:3.2 kV。离子源温度:3500C。碰撞气:氧气。监测模式:选择离F监测。农业部1486号公告一5-20104种阿维菌素类药物的定性离子和定量离子见表1。药物埃普利诺菌素阿维商素-一一一一多拉商素伊维闲素7. 3. 3 液相色谱一质谱测定7. 3. 3. 1 定性测定表14种阿维菌素类药物的选择离子定性离子，m/z936.6 ,352.0,490.0 895.6 ,327.4,449.3 92 1. 5,353.2,449.0 89
9、5，329. 1,753.3 定f式离子，m/z936. 6 895. 6 92 1. 5 897.6 根据试样挥手液中药物的含量，选择峰面积相近的标准t作液和样品榕液等体积参插进样。通过液相色谱保留时间与质谱选择离子共同定性。样品中待测药物与标准物质的保留时间相对偏差不大于2.5%，而且，其选择离子的相对丰度的差异不大于10%04种药物的标准榕液选择离子色谱图见图A.1。7. 3. 3. 2 定量测定分别取适量试样榕液和相应浓度的标准工作液，作单点校准或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性也罔内，试样液进样过程中应参插标准士作液，以便准确定量
10、。8 结果计算与表达饲料中阿维菌素类药物的含量X，以质量分数Cmg/kg)表示，按式(1)计算:CXVXn X二(1)m 式中:C一一试样液中对应的阿维菌素类药物的浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V一一试样液总体积，单位为毫升CmL);n一-稀释倍数;m 试样质匠，单位为克(g)。测定结果用平行测定后的算术平均值表示，保留气位有效数字。9 精密度在重复性条件下完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于20%。3 农业部1486号公告一5-2010附录A(资料性附录)标准溶液选择离子色谱图Intens xl0 2 07090707.D:EIC 936.6+All MS ,SmoothedC 1
11、.5 , I ,GA) 。xl0 07090707.D:EIC 895.6+All MS ,SmoothedC 1.5 , I ,GA) 卜nudynU气unu-UJ-uutinunuhnr 0709070饥D:EIC921.6+All MS ,SmoothedC 1.5 , I , GA) 0.0-D:EIC 8叨6+All MS , Smoothed C 1.5穴0.5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Timemin 图.12g/mL阿维菌素类药物选择离子色谱图(m/ z 936. 6为埃普利诺菌京;m/z895. 6为阿维菌京;m/z92 1. 5为多拉阙索;m/z897.6为伊维菌素)4
