1、ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准农业部1486号公告-9一2010饲料中氯烯雌酷的测定高效液相色谱法Determination of chlorotrianisene in feeds High-performance liquid chromatography 2010-11-16发布2010-11-16实施?口:中华人民共和国农业部发布目。吕本标准遵照GBjT1. 1-2009给111的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提:11。本标准由全国饲料t业标准化技术委员会CSACjTC76)归口。本标准起草单位:农业部饲料质量监督检验测试中心(成都)。农业部14
2、86号公告-9-2010本标准主要起草人:柏凡、赵立军、高庆军、赵彩会、张自强、廖峰、冯娅。范围饲料中氯烯雌酷的测定高效液相色谱法农业部1486号公告一9-2010本标准规定了测定饲料中氯烯雌酷含量的高效液相色谱法(HPLC)。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。本标准的检测限为0.1mg/峙，定量限为0.3mg/kg。2 规范性引用文件F列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1饲料采样GB/T
3、20195动物饲料试样的制备3 原理用乙睛从饲料中提取氯烯雌膛，离心后取上清液经过C18固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪紫外检测器在307nm处测定。外标法计算其含量。4 试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂。4. 1 色谱分析用水符合GB/T6682中-级水的规定。4.2 甲醇:色谱纯。4. 3 乙睛:色谱纯。4.4 25%氨水。4.5 流动相:甲醇十水=82十四。4.6 氯烯雌酷储备液:准确称取适量氯烯雌酷标准品(纯度二三95%)，用甲醇(4.2)溶解、定容至100mL。此贮备液浓度为100g/mL，密封贮于4C冰箱内，有效期为一个月。4. 7 氯烯雌酿中间液:准确移取适量
4、氯烯雌酷储备液(4.6)配制，保存于4C冰箱内，有效期为一周。4.8 标准工作榕液:分别准确移取氯烯雌酷储备液和中间液，用甲醇(4.2)配制成标准工作溶液:0.05g/mL、1.0g/mL、2.0g/mL、5.0g/mL、10.0g/mL、20.0g/mL。现配现用。4.9 淋洗液的配制:25%氨水(4.4)十水(一级)二5十95。4. 10 C18固相萃取小柱:200mg/3 mL 5 仪器和设备5. 1 实验室用样品粉碎机。5. 2 分析天平:感量0.1mg。5.3 离心机:转速为5000r/min以上。农业部1486号公告-9-20105. 4 超纯水器。5. 5 超声波清洗器。5. 6
5、 涡旋混合器。5. 7 振荡器。5. 8 密封盖塑料离心管:50mL。5. 9 固相萃取装置。5. 10 高效液相色谱仪:配备紫外检测器。5. 11 氮吹仪。6 试样的制备按GB/T14699.1的规定采集试样后，按GB/T 20195的规定，选取具有代表性的实验室样品lkg，四分法缩减分取200g左右，粉碎过1mm孔筛，混匀装人磨口瓶中备用。7 分析步骤7. 1 提取准确称取配合饲料5g、浓缩饲料或添加剂预混合饲料称取2g(精确到0.01g) ，置于离心管(5.8)中，加入提取液乙睛(4.3)10.0mL，涡旋振荡2min。然后将离心管(5.8)置于振荡器(5.7)上振荡20mln，然后在离
6、心机(5.3)上以5000r/ min离心5min，吸取上清液于另一具塞试管中，待净化。7.2 SPE柱净化每一试样各准备一只C18小柱(4.10)，依次用3mL甲醇(4.2)、3mL蒸馆水、3mL甲醇(4.2)活化。将提取液(7.1)3.0mL与等体积的蒸馆水混合均匀后，吸取5.0mL过此小柱(流速1.0 mL/ min)。用6mL淋洗液(4.的淋洗，最后用3mL甲醇(4.2)洗脱，收集洗脱液于10mL试管内，洗脱液于500C下用氮气吹干，残余物用1.0 mL甲醇(4.2)定容，涡旋混合1min，过0.45m滤膜作为试样制备液，供高效液相色谱测定。7.3 HPLC测定参数的设定检测器:紫外检
7、测器，检测波长:307nm; 色谱柱:C18柱，5m，250mmX4. 6 mm，或性能类似的色谱柱;流动相:甲醇+水二82十18;流速:1. 0 mL/ min; 柱温:300C;进样量:20L。7.4 HPLC测定取适量试样制备液(7.2)和相应浓度的标准工作榕液(4.的，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。当分析物浓度不在线性范用内时，应将分析物稀释或者浓缩后再进行检测。8 定性8. 1 总则如果从峰形、测定数值对氯烯雌酷的峰产生怀疑，则必须用二极管阵列检测器(8.2)来定性。8. 2 二极管阵列检测器8.2. 1 条件色谱测定条件同7.3的规定，只是将紫外检测器换为二极管阵列检测
8、器，具体参数如下:2 农业部1486号公告-9-2010参数测定波长频带宽度参比波长参比频带宽度光谱范围光谱值8. 2. 2 步骤设定307 nm 4 nmp波长(307士2)nmJ 450 nm 10Onm 20Onm丑1、飞白、.基线、峰最大值、上升拐点斜率和下降拐点斜率HPLC系统稳定后，依次注入适量浓度的氯烯雌耻标准工作溶液(4.8)、有疑问的试样制备液(7.2)和又一适量浓度的氯烯雌酷标准工作榕液(4.8)。记录、存储各个色谱峰的基线、最大值以及峰两侧的拐点数据。8. 2. 3 评价将试样色谱峰不同光谱值归一化并绘制成图，记录峰值和峰前后的拐点值。分别将试样峰光谱和刽烯雌酷标准系列榕
9、液的光谱归一化，并绘图，在峰顶处标示。8.2.4 定性标准样品峰只有满足下列条件才能证实是氯烯雌酷:a) 样品峰的保留时间应与标准峰的保留时间相同(差异运士5%)。b) 样品峰的纯度评定是基于所记录的峰顶、上升拐点斜率和下降拐点斜率不同光谱的符合程度。所有光谱图每个波长的相对吸收值应该相等(差异:1:15%)。c) 样品峰和标准峰的最大吸收波长应该相同，即其差异不大于检测系统分辨率决定的范围(一般是2nm4 nm)，两个光谱图任意观察点的偏差均不能超过该特定波长下标准测定物吸收值的15%。9 计算结果9. 1 饲料中氯烯雌隘的含量X，以质量分数(mg/kg)表示，按下列式(1)计算:x_LXC
10、乙二三V，X卫. (1) P , X m X Vi X 2. 5 式中:Pi二一试样榕液峰面积值;c一一标准榕液浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V，一一标准榕液进样体积，单位为微升(L);V一一提取液体积，单位为毫升(mL);PS 标准榕液峰面积值;m 称取饲料的质量，单位为克(g);Vi 一试样挥手液进样体积，单位为微升(L)。9.2 按平行测定的算数平均值报告结果，计算结果保留气位有效数字。10 精密度10. 1 重复性在同一实验室，由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%;以两次平行测定结果的平均值为测定结果。3 农业部1486号公告一9一201010.2 再现性在不同的实验室，由不同的操作人员用不同的仪器设备完成的测定结果，相对偏差不大于20%。4 农业部1486号公告-9-2010附录(资料性附录)氯烯雌醋标准色谱图和光谱图A 氯烯雌酷标准色谱图见图A.l。A.1 NE寸.EmAU 2.5 2 1.5 0.5 mm 17.5 15 12.5 10 7.5 5 2.5 。氯烯雌酷标准色谱图图.1氯烯雌酷标准克谱图见图A.2。A.2 m n 句IA叫/;/ ,JJJd / .jJ1111 mMW川刊另列。N 15 nu l 25 20 5 。nml 380 360 340 320 300 280 260 240 氯烯雌酷标准光i普图图.25
