1、ICS 67050x 04中华人民共和国国家标准农业部869号公告-2-2007转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法Food safety detection of genetically modified organisms and delved productsMethod of target protein digestive stability in simulative gastricand intestinal fluid20070611发布 20070801实施中华人民共和国农业部发布刖 吾农业部869号公告一22007本标准由中华人民共和国农业部
2、科技教育司提出。本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业大学。本标准主要起草人：黄昆仑、唐茂芝、段武德、罗云波、贺晓云、刘信、宋贵文、沈平、许文涛、厉建盟。本标准为首次发布。转基因生物及其产品食用安全检测模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法1范围本标准规定了外源蛋白质在模拟胃液和模拟肠液消化稳定性的检测方法。本标准适用于转基因生物及其产品中外源基因表达蛋白质或者用微生物表达的与植物中的外源蛋白具有实质等同性的蛋白质产物在模拟胃液和模拟肠液消化条件下稳定性的检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。21外源蛋白质exogenous
3、protein从转基因生物中提取的通过基因工程手段转入生物中的外源基因所表达的蛋白质产物，或者将转基因植物中的外源基因转入微生物中所表达的与植物中的外源蛋白质具有实质等同性的蛋白质产物。2。2模拟胃消化液stimulated gastric fluid(SGF)模拟人体胃液中的pH、盐离子浓度及胃蛋白酶浓度设置的消化液。23模拟肠消化液stimulated intestinal fluid(SIF)模拟人体肠液中的pH、盐离子浓度及胰酶浓度设置的消化液。24稳定对照蛋白stable control protein为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃肠液中60 min内不能被完全消化的蛋白
4、质。2 5不稳定对照蛋白labile control protein为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃肠液中2 min内完全被消化的蛋白质。3原理根据人体胃肠消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟胃肠消化体系，将转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在该体系中进行消化，对不同消化时间的样品进行蛋白电泳和蛋白印迹，确定该蛋白在模拟胃液和模拟肠液中被消化的时间，推断转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在模拟人体胃肠消化过程中的稳定性。4试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯化学试剂和重蒸馏水。4 1模拟胃消化液(SGF)：本标准中采用的胃蛋白酶(pepsin)活力不能低于2 000
5、 Umg。根据公式(1)计算100 mL模拟胃液中的胃蛋自酶的添加量：d=曼兰!Q!n19xB农业部869号公告一22007式中：A胃蛋白酶添加量，单位为毫克(rng)；B胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克(Umg)。称取02 g氯化钠(NaCl)和Amg胃蛋白酶，加入70mL重蒸馏水，加入730止。盐酸，再用盐酸调pH至12，加水定容至100 mL。现用现配。42 02molL氢氧化钠溶液：称取089氢氧化钠(N柏H)，溶于重蒸馏水中，定容至1130mL。4 3模拟肠消化液(SIF)：本标准中采用的胰酶(pancreatin)应满足40C 5 min内，能将其质量的25倍的淀粉转化为水溶性的
6、碳水化合物；40C 60 rnln内(pH75)，消化掉其质量的25倍的酪蛋白；37(pH90)，每毫克胰酶每分钟能够从橄榄油中至少水解生成2tmol脂肪酸。称取07 g磷酸二氢钾(KH2P04)溶于25mL重蒸馏水中，振荡使之完全溶解，加入19mL 02molL氢氧化钠溶液和40mL重蒸馏水，加入109胰酶，用02molL氢氧化钠溶液调pH至75，加重蒸馏水定容至100 mL。现用现配。44样品蛋白溶液：441模拟胃液消化样品蛋白溶液(59L)：称取5mg样品蛋白，定容于1mL重蒸馏水中，混匀。442模拟肠液消化样品蛋白溶液(29L)：称取2mg样品蛋白，定容于l mL重蒸馏水中，混匀。45
7、不稳定对照蛋白溶液：451模拟胃液消化不稳定对照蛋白溶液：选用酪蛋白(acasein)或牛血清白蛋白(bovine serurll albumin，BsA)作为模拟胃液消化不稳定对照。配制方法同44i。452模拟肠液消化不稳定对照蛋白溶液：选用酪蛋白(acasein)或牛p一乳球蛋白B(bovine plactoglobulin，BLG)作为模拟肠液消化不稳定对照。配制方法同442。46稳定对照蛋白溶液：46 1模拟胃液消化稳定对照蛋白溶液：选用牛8哥L球蛋白B(BLG)或大豆胰蛋白酶抑制剂(soybeantrypsin inhibitor，sTI)作为模拟胃液消化稳定对照。配制方法同441。
8、462模拟肠液消化稳定对照样品溶液：选用牛血清白蛋白(BsA)或大豆胰蛋白酶抑制剂(sTI)作为模拟肠液消化稳定对照。配制方法同442。4 7 02molL碳酸氢钠(NmHC03)溶液：称取17 g碳酸氢钠(NaHC03)，溶于重蒸馏水中，定容至100mL。48 3mo|L盐酸溶液：量取26mL盐酸，加重蒸馏水定容至100mL。49分离胶缓冲液(15molL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(Tris-HCl)，pH88)：称取91 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加45mL重蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用3molL盐酸溶液调pH至88，再加水定容至50 mL，4C下贮存备用。4 10浓缩胶缓
9、冲液(10molL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(Tris-HCl)，pH 68)：称取309Z羟甲基氨基甲烷(Tris)，加45mL重蒸馏水，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，用3molL盐酸溶液调pH至68，再加水定容至50 mL，4C下贮存备用。411 300 gL丙烯酰胺单体储液(AcrBis)：称取291 g丙烯酰胺(Acr)，09 gN，N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，溶于80mL重蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加水定容至100mL，滤纸过滤，4下避光保存备用。2农业部869号公告22007412 100 gL十二烷基磺酸钠(sDs)：称取509十二烷基磺酸钠(SDS)溶于45mL重蒸
10、馏水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解，加水定容至50mL。413 100 gL过硫酸铵(AP)：称取0，1 g过硫酸铵(AP)，溶于1 mL重蒸馏水中。4C中保存，并在1周内使用。414蛋白样品上样缓冲液(5Laemmli buffer，pH 68)：称取100 g十二烷基磺酸钠(SDS)，加入40mt1于油，33 rrlL浓缩胶缓冲液(pH68)，5mL p一巯基乙醇，加水定容至100mL，再加人005 g溴酚蓝，混匀。415 509L三氯乙酸(亿A)：称取509三氯乙酸(aV。A)，溶于100n1L重蒸馏水中。现用现配。416十二烷基磺酸钠(SDS)洗脱液：在455 mL甲醇中加入90 mL
11、乙酸，用水定容至1 000 mL。417考马斯亮蓝染色液：量取150 rnL甲醇，100mL冰乙酸，加水定容至1 000mL，再加入10 g考马斯亮蓝，混匀，滤纸过滤后使用。4 18脱色液：在250 mL甲醇中加入75 mL乙酸，加水定容至1 000 mL。419电泳缓冲液：称取3，0 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，144 g甘氨酸，109十二烷基磺酸钠(SDS)，溶于800mL重蒸馏水中，用3molL盐酸溶液调pH至83，加水定容至1 000mL。420转移缓冲液：称取32 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，144 g甘氨酸，甲醇200 mL，加水定容至1000mL。421 TBS缓冲液：称
12、取129三羟甲基氨基甲烷(THs)，889氯化钠(c】)，加800mL重蒸馏水，用3 molL盐酸溶液调pH至75，加水定容至1 000 mL。4 22 TBSTl缓冲液：在500mLTBS缓冲液中，加入250pL吐温20(Tween 20)，用磁力搅拌器混匀。423 TBST2缓冲液：称取30 g三羟甲基氨基甲烷(T“s)，44 g氯化钠(NaCI)，加重蒸馏水400mL，再加入500“L吐温20(Tween 20)，搅拌混匀，加水定容至500 mL。424碱性磷酸酶显色缓冲液：称取12 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，06 g氯化钠(NaCI)，10 g氯化镁(MgCl26H20)，加80
13、 mL重蒸馏水溶解，定容至100 mL。4 25蛋白印迹显色液：加66肛L四氮唑兰(NBT)溶液于lOmL碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀后，加入33止5一溴一4一氯一3吲哚一磷酸盐(BcIP)溶液，混匀。现用现配。426封闭液：在50ttLTBSTl缓冲液中加入15 g牛血清白蛋白(BSA)，混匀。427一抗工作液：在50mL封闭液中，加入50止目标蛋白抗血清。428二抗工作液：在20mLTBST2缓冲液中，加人02 g牛血清白蛋白(BSA)，混匀溶解后，再加入20止碱性磷酸酶标记二抗。429 15分离胶：按表1依次吸取各种组分于50 mL锥形瓶中，其间摇动混匀。表1 15分离胶的配制各种溶液组
14、分名称 各组分的取样量(mL)重蒸馏水 23300 gL丙烯酰胺储液(AerBis) 5O分离胶缓冲液 25100 gL十二烷基磺酸钠(sDs) 01100 gL过硫酸铰(AP) O1N，N，N，N四甲基二乙胺(TEMED) 0004总体积 10430 5浓缩胶3按表2依次吸取各种组分于50mL锥形瓶中，其间摇动混匀。表2 5浓缩胶的配制各种溶液组分名称 各组分的取样量(mE)重蒸馏水 34300 gL丙烯酰胺储液(AcrBis) 083浓缩胶缓冲液 063100 gL十二烷基磺酸钠(SDS) O05100 gL过硫酸铵(AP) 005N，N，N，No四甲基二乙胺(TEMED) 0005总体积
15、 5431 PVDF转印膜。432滤纸。5仪器51恒温水浴(温度波动范围：01)。52紫外分光光度计。53电泳槽、电泳仪等蛋白电泳装置。54蛋白免疫印迹装置。55凝胶成像系统或照相系统。56重蒸馏水发生器。57可调式电炉。58电子夭平(感量00001 g与感量01 g)。59其他分子生物学实验室仪器设备。6操作步骤61模拟胃肠液消化试验反应时间反应时间设置为0 S、15 s2 min、30 min和60 min。62试验重复和平行样品设置每个蛋白样品重复进行两次试验，每次试验进行3次电泳。63模拟胃液消化试验63 1反应时间为0 s的模拟胃液消化试验在15mL离心管中加入190止模拟胃消化液(
16、sGF)，37恒温水浴5min。加入10止样品蛋白溶液或对照蛋白溶液(5 gL)，同时加入70止02molL碳酸氢钠溶液，漩涡振荡后，冰浴，加入70止蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5 rain，取出后冷却至室温备用。6 3 2反应时间为15 s、2 min、30 min、60 min的模拟胃液消化试验在7mL离心管中加入19mL模拟胃消化液(SGF)，37恒温水浴5min。加入100L样品蛋白溶液或对照蛋白溶液(5 gL)，迅速漩涡振荡并快速置于37C水浴，准确记录时间，在每个反应时间点，迅速吸取反应液200止，加入15mL离心管中(含有70止02molL碳酸氢钠溶液)，冰浴，加入70肛L蛋白样品
17、上样缓冲液，沸水浴5 min，取出后冷却至室温备用。6 3 3胃蛋白酶对照在15mL离心管中加入190 pL模拟胃消化液(sGF)，再加入10止重蒸馏水和70”L 02molL4农业部869号公告22007碳酸氢钠溶液，漩涡振荡后，加入70肚L蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5 min，取出后冷却至室温备用。634试样蛋白对照在15 n1L离心管中加入190止不含胃蛋白酶的模拟胃缓冲液，再加入10止样品蛋白或对照蛋白(59L)，同时加入70txL 02molL碳酸氢钠溶液，漩涡振荡后，加入70L蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5 min，取出后冷却至室温备用。64模拟肠液消化试验641反应时间为0 s的模
18、拟肠液消化试验在15 rnL离心管中加入190vL模拟肠消化液(SIF)溶液，37恒温水浴5min。加入10止样品蛋白溶液或对照蛋白溶液(2 gL)，漩涡振荡后，立即加入50止蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5 min，取出后冷却至室温备用。6 42反应时间为15 s、2 min、30 rain、60 min的模拟肠液消化试验在7mL离心管中加入19mL模拟肠消化液(SIF)溶液，37恒温水浴5mln。加入100止样品蛋白溶液或对照蛋白溶液(2 gL)，迅速漩涡振荡并快速置于37水浴中，准确记录时间，在每个反应时间点，迅速吸取反应液200vL，加入15mL离心管中，立即加入50止蛋白样品上样缓冲液，
19、沸水浴5min，取出后冷却至室温备用。643胰蛋白酶对照在15mL离心管中加入190pL模拟肠消化液(SIF)，再加入10肛L重蒸馏水，漩涡振荡后，立即加入50止蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5min，取出后冷却至室温备用。644试样蛋白对照在15n1L离心管中加人190止不含胰酶的模拟肠缓冲液，再加入10止样品蛋白或对照蛋白(2gL)，漩涡振荡后，立open人50“L蛋白样品上样缓冲液，沸水浴5rain，取出后冷却至室温备用。65十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳【SDSPAGE)6 5 1取出两块玻璃板，用自来水洗净后，蒸馏水冲洗一次，置37烘干或晾干，梳子用自来水洗净，晾干。65 2分离胶的
20、制备在50mL锥形瓶中依次加入表1中的溶液，轻轻摇动混匀溶液，避免气泡产生。以平稳流速缓慢地将分离胶溶液从玻璃夹板的中间位置注入玻璃夹板中，在液面距凹板上平面23 crn处停止注入，再以相同的方法将水注入玻璃夹板中，水面距分离胶液面约23 crn时停止注入，静置至凝胶形成。653浓缩胶的制备在50mL锥形瓶中依次加人表2中的溶液，轻轻摇动混匀溶液，避免气泡产生。待分离胶完全聚合(胶面与上面的水相有明显的界面)，吸净上层液体。以平稳流速缓慢地将浓缩胶溶液从玻璃夹板的中间位置注入玻璃夹板中，直到凹形玻璃板顶端，立BPtl,心插入梳子。6 5 4待浓缩胶完全聚合后，取下夹子和环绕在玻璃板周围的乳胶条
21、，不要改变玻璃板的相对位置。6 5 5在电泳槽两侧的电极槽中注入电泳缓冲液，缓冲液与凝胶上下两端之间避免产生气泡。小心取下梳子。6 5 6在玻璃板上做记号，将63,64处理的样品取15止加入点样孔中。样品加入顺序：1：蛋白marker；2：蛋白酶对照样品；3：试样蛋白对照样品；48：模拟胃肠液消化样品(0 s，15 S，2 min，30 min，60 min)。65 7接好电泳槽正负极，打开电源开关，调节电压至80 v，以恒电压方式电泳。当溴酚蓝染料前沿进入分离胶后，电压提高到120V，直至溴酚蓝迁移至凝胶下端附近，约距下端1 cm左右，关闭电源，停止电泳。5658从电泳装置上卸下双层玻璃夹板
22、，撬开玻璃板，在凝胶点样孔上部切除一角标注凝胶的方位。659将凝胶在50 gL三氯乙酸(TCA)溶液中轻轻振荡5min，取出后在十二烷基磺酸钠(SDS)洗脱液中振荡12 h。6510取出后在考马斯亮蓝染色液中浸泡染色10min以上，然后用脱色液脱色直至条带清晰。6511取出凝胶，置于凝胶成像仪上，使用凝胶图像分析系统照相，并保存图像。66蛋白印迹(此步操作仅针对测试样品蛋白l661按651-657进行SDS-PAGE。662从玻璃板上取下凝胶，切除所有浓缩胶。根据分离胶的大小，剪成与凝胶同样大小的PVDF转印膜和滤纸6张。663将凝胶浸入转移缓冲液中15-30 min。664将滤纸浸入转移缓冲
23、液中30 S以上。6 6 5在甲醇中润湿PVDF转印膜15 s，使膜均匀地由不透明变成半透明。小心将膜放人重蒸馏水中浸泡2 min，再将膜小心放人转移缓冲液中浸泡5 min以上。666将转移夹放人转移槽，转移夹的凝胶侧面面向阴极(一)，膜侧面面向阳极(+)。向转移槽中加入适量缓冲液，将转移夹完全浸没。于4冰箱中连接转移装置正负极，打开电流，在电流100 mA转移6 h。667转移完成后，用镊子小心取出PVDF膜，用TBS缓冲液洗膜3次，每次1 min。6 6 8加人封闭液，在室温下，45 rrain振荡2 h，然后在4静置封闭过夜。669倒掉封闭液，加入一抗工作液，室温下45 rmin振荡3
24、h。倒掉一抗工作液，加入TBSTl缓冲液洗膜3次，每次45 rmin振荡10min。66 10倒掉TBSTl缓冲液，加入二抗工作液，室温下振荡45 rmin振荡1 h。倒掉二抗工作液，加入TBSI2缓冲液洗膜3次，每次45 rmin振荡10 min。6611 倒掉TBST2缓冲液，加入显色液显色，轻轻晃动直到条带清晰，倒掉显色液加入重蒸馏水终止反应。6612使用凝胶图像分析系统照相，并保存图像。7结果分析与表述71对照样品结果分析在模拟胃肠消化试验中，不稳定对照蛋白可以2min内被完全消化，而稳定对照蛋白在60min内不能被消化，表明模拟胃肠消化试验体系工作正常；否则需要查找原因重新进行试验。
25、72试样蛋白结果分析与表述在试验体系工作正常的情况下，根据SDS-PAGE电泳图谱和蛋白印迹图谱中试样蛋白条带及其可见降解片段消失的时间来判断蛋白的可消化性。试样蛋白在模拟胃液和模拟肠液中的可消化性分别表述为：a)试样蛋白及其可见降解片段在O15 S内全部消化，表述为该蛋白在模拟胃肠液中极易消化。b)试样蛋白及其可见降解片段在15 s2 min内全部消化，表述为该蛋白在模拟胃肠液中易消化。c)试样蛋白及其可见降解片段在230 min内全部消化，表述为该蛋白在模拟胃肠液中可消化。d)试样蛋白及其可见降解片段在3060 min内全部消化，表述为该蛋白在模拟胃肠液中难消化。6e)试样蛋白及其可见降解片段于60 rain仍不能被全部消化，表述为该蛋自在模拟胃肠液中极难消化。7
