1、ICS 67050X 04中华人民 共禾口、I 1 国国家标准农业部869号公告一52007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法Detection of Genetically Modified Plants and Derived ProductsQualitative PCR Method for Herbicide-Tolerant Rapeseed MS8、PF3 andTheir Derivates20070611发布 20070801实施中华人民共和国农业部发布刖 昂农业部869号公告一52007本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准归口
2、全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所。本标准主要起草人：卢长明、武玉花、宋贵文、吴刚、肖玲、沈平、连庆。农业部869号公告一52007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MS8、RF3及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了抗除草剂油菜MS8、RF3及衍生品种的转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于抗除草剂油菜MS8、RF3及其杂交种MS8RF3等衍生品种和制品中MS8、RF3和MS8RF3的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修
3、改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31HMGlY基因HMGIy gene高移动簇蛋白IY(High Mobile Group Protein IY)基因。32PTA29启动子PTA29 promoter来自烟草(Nicotiana tabacum)花药组织特异基因TA29的启动子。333g
4、7终止子3g 7 terminator来自土壤农杆菌(Agrobacterium tumifaciens)TL-DNA基因7的终止子。3 4Ms8转化体event Ms8通过农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因缸r(抗除草剂草胺膦基因)和barnase(核糖核酸酶基因)同时导入受体油菜品种Drakkar，获得的一个抗草胺膦不育单株。3 5RF3转化体event RF3通过农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因bar(抗除草剂草胺膦基因)和barstar(编码核糖核酸酶抑制物基因)同时导人受体油菜品种Drakkar，获得的一个抗草胺膦可育单株。3 6MS8转化体特异性序列eventspecific s
5、equence of MS8MS8外源插入片段5 7端与油菜基因组的连接区序列，包括3 7酊终止子3端部分序列和油菜基因组】农业部869号公告一52007的部分序列。3 7RF3转化体特异性序列eventspecific sequence of RF3RF3外源插入片段5端与油菜基因组的连接区序列，包括3 7酊终止子3 7端部分序列和油菜基因组的部分序列。38杂交油菜MS8 x RF3 canola hybrid MS8 x RF3油菜雄性不育系MS8和育性恢复系RF3杂交产生的Fl代。4原理根据抗除草剂油菜MS8和RF3中PTA29启动子、MS8转化体特异性序列、RF3转化体特异性序列设计特
6、异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得266 bp、159 bp、284 bp的预期DNA片段，检测试样中是否含有PTA29启动子、抗除草剂油菜MS8、RF3。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。51琼脂糖5 2 109L溴化乙锭IEB)溶液称取10 g溴化乙锭(EB)，溶解于100mL水中。注：Ell有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。53 10 molL氢氧化钠溶液称取800 g氢氧化钠(NaOI)，加160mL水溶解后，再加水定容到200mL。54 500 mmolL乙二铵四乙酸二钠溶液pH8 0)称取1869乙二铵四乙酸二钠(EDTA-
7、Na2)，加入70mL水中，加入适量氢氧化钠溶液(53)，加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液(53)调pH至80，用水定容到100mL。在1034 kPa(121(2)条件下灭菌20 min。55 1 molL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH80)称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸(HCl)调pH至8O，用水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 min。56 TE缓冲液(pH8 0)分别量取lOnlL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，加水定容至1 000 rnL。在1034 kPa(
8、1216C)条件下灭菌20 min。57 50TAE缓冲液称取24229三羟甲基氨基甲烷，加入300 rnL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容到1 000mL。使用时用水稀释成1TAE。58加样缓冲液称取2500mg溴酚蓝，加入10 n1L水，在室温下溶解12 h；称取2500mg二甲基苯腈蓝，加101L水溶解；称取5009蔗糖，加30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4下保存备用。59 DNA分子量标准可以清楚地区分50 bp-1 000 bp的DNA片段。510 dNTPs混合溶液将浓度为10 mmolL的dAT
9、P、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。2511 TaqI)NA聚合酶15um)及PCR反应缓冲液512引物5121 HMG JY基因。hmwF：5-TC(1TCCGT丌C叽GCC一3hmg R：5-TTCCACGCCCTCTCCG吁3预期扩增片段大小206 bp。5122 PTA29启动子序列。PTA29一F：5-TAAGGTGGGTGGCTGGACTA+3Pn气29一R：5-ACrrGCACCAC 6 6GGGCATA一3预期扩增片段大小为266 bp。5123 MS8转化体特异性序列。RMS8一F：50CCrHTCrTATCGACCATG，rACTc_3RMS8一R
10、：5LAAl广rAAAAACTTG|TGGGATGl日一3预期扩增片段大小159 bp。5 124 RF3转化体特异性序列。Rrf3一F：5一CAATAACTl1G1113GG(_rTA7IYj3Rrf3一R：5-CrCGTC玎3GGACCTCCGAA2XACC-37预期扩增片段大小284 bp。513引物溶液用TE缓冲液(56)分别将上述引物稀释到10 btmolL。514石蜡油5。15 PCR产物回收试剂盒6仪器61重蒸馏水发生器或超纯水仪。62 PCR扩增仪。63电泳槽、电泳仪等电泳装置。64紫外透射仪。6 5凝胶成像系统或照相系统。6 6分析天平，感量01 rng。67其他分子生物学实
11、验仪器设备。7操作步骤7 1抽样按NYT 672和NYT 673规定执行。7 2制样按NYT 672和NYT 673规定执行。7 3试样预处理按NYT 674规定执行。74 DNA模板制备按NYT 674规定执行。农业部869号公告一520073农业部869号公告一5200775 PeR反应7 5 1试样PCR反应7 5 1 1每个试样PCR反应设置三次重复。7512在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50止石蜡油(有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油)。7 5 1 3将PCR管在台式离心机上离心10 S后插入PCR仪中，进行PCR反应。7514检测MS8转化体反应程序为
12、：94变性5min；进行35次循环扩增反应(94变性30 S，56退火30 s，72延伸45 S)；72延伸7 min。75 1 5检测RF3转化体反应程序为：94变性5 min；进行35次循环扩增反应(94变性30 S，61退火30 s，72延伸45 s)；72延伸7 min。7，51 6检测PTA29启动子和内标准基因HMGIY的反应程序为：94变性5min；进行35次循环扩增反应(94变性30 S，58退火30 s，72延伸45 S)；7212延伸7min。7 5 1 7根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长。反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检
13、测。表1 PCR反应体系试 剂 终浓度 单样品体积无菌水 3175止10xPCR缓冲液 l 5 uL25 mmolL氯化镁溶液 25 nunolL 5止dNTPs混合溶液 02 rentalL 1,uL10wnolL上游引物 05“rnolL 25 uL10wnolL下游引物 05 wnolL 25“L5 U止，Taq酶(热启动) 0025 U止 025“L259LDNA模板 1 gL 20止总体积 50 uL注1：如果10xPCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，用无菌水补齐；注2：油菜内标准基因PeR检测反应体系中，上、下游引物分别为hmgF和hmgR；PTA29启动子PCR检测反应体
14、系中，上、下游引物分别为PTA29 F和PTA29R；MS8转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为RMS8一F和RM。q8一R；RF3转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为Rrf3一F和Rrf3一R。752对照PCR反应7521在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与751相同。7522以非转基因油菜材料提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板。7523用含0110抗除草剂杂交油菜MS8RF3基因组DNA的样品作为阳性对照PCR反应体系的模板。7524用无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。7
15、6 PCR产物电泳检测按20 gL的浓度称量琼脂糖加入1TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制琼脂糖溶液，然后按每100mL琼脂糖溶液中加入5“LEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放人1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。吸取7“LPCR产物与4农业部869号公告一520073,aL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2 Vcm-5 Vcm条件下电泳。7 7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电
16、子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照78和79的规定执行。78 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。7 9 PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，并对测序结果进行比对和分析，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述81对照样品结果分析阳性对照的PCR反应中，HMGY内标准基因、基因表达调控元件PTA29启动子、MS8转化体特异性序列和RF3转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出皿憾
17、JY基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则重新检测。82试样检测结果分析和表述8 21 HMG JY内标准基因和基因表达调控元件PTA29启动子得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，结果分为4种情况：a)MS8转化体特异性序列得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，RF3转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期不一致，表明该样品检出抗除草剂油菜MS8成分，表述为“试样中检测出抗除草剂油菜MS8成分，检测结果为阳性”。b)RF3转化体特异性序列得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，MS8转化体特异性序列未得到扩增，
18、或扩增片段大小与预期不一致，表明该样品检出抗除草剂油菜RF3成分，表述为“试样中检测出抗除草剂油菜RF3成分，检测结果为阳性”。c)MS8转化体特异性序列和RF3转化体特异性序列均得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，表明该样品检出抗除草剂油菜MS8和RF3成分。表述为“试样中检测出抗除草剂油菜MS8和RF3成分，检测结果为阳性”。如需确定试样是否含杂交油菜MS8RF3，需进一步单粒检测。如果单粒种子同时检测出抗除草剂油菜MS8和RF3成分，表明试样含杂交油菜MS8RF3。表述为“试样中检测出抗除草剂杂交油莱MS8RF3成分，检测结果为阳性”。d) MS8转化体特异性序列和RF3转化体特异性序列没有得到扩增或扩增片段大小与预期不一致，表明该样品未检出抗除草剂油菜MS8和RF3，表述为“试样中检测出PTA29启动子、未检测出抗除草剂油菜MS8和RF3成分”。8 2 2仅有HMG JY内标准基因片段得到扩增，表明未检测出抗除草剂油菜MS8和RF3成分，表述为“试样中未检测出抗除草剂油菜MS8、RF3成分，检测结果为阴性”。8 23 HMG IY内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，不作判定。
