1、ICS 67050X 04中华人民共和国国家标准农业部869号公告一62007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MSl、RF2及其衍生品种定性PCR方法Detection of Genetically Modified Plants and Derived ProductsQualitative PCR Method for Herbicide-Tolerant Rapeseed MSlRF2and Their Derivates20070611发布 2007-0801实施中华人民共和国农业部发布刖 瞢农业部869号公告一62007本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准归13全国农业转基
2、因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所。本标准主要起草人：卢长明、武玉花、宋贵文、吴刚、肖玲、沈平、刘培磊。I农业部869号公告一62007转基因植物及其产品成分检测抗除草剂油菜MSl、RF2及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了抗除草剂油菜MSl、RF2及衍生品种的转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于抗除草剂油菜MSl、RF2及其杂交种MSlRF2等衍生品种和制品中MSl、RF2和MSlRF2的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单(不
3、包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31HMG IY基因ttMG IY gene高移动簇蛋白IY(High Mobile Group Protein iY)基因。32PTA29启动子PTA29 promoter来自烟草(Nicotiana tabacum)花药组织特异基因TA29的启动子。3，33g
4、7终止子3g 7 terminator来自土壤农杆菌(Agrobacterium tu711ifaciens)TL-DNA基因7的终止子。34lVlSl转化体event MSl通过农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因bar(抗除草剂草胺膦基因)和barnase(核糖核酸酶基因)同时导人受体油菜品种Drakkar，获得的一个抗草胺膦不育单株B914。35RF2转化体event RF2通过农杆菌介导的遗传转化方法将外源基因bar(抗除草剂草胺膦基因)和barstar(编码核糖核酸酶抑制物基因)同时导入受体油菜品种Drakkar，获得一个抗草胺膦可育单株B94-2。36MSl转化体特异性序列event
5、-specific sequence of MSlMSl外源插入片段57端与油菜基因组的连接区序列，包括3g 7终止子3端部分序列和油菜基因1农业部869号公告一62007组的部分序列。37RF2转化体特异性序列event-specific sequence of RF2RF2外源插入片段5 7端与油菜基因组的连接区序列，包括3 797终止子3端部分序列和油菜基因组的部分序列。38杂交油菜MSlRF2 canola hybrid MSI X RF2抗除草剂油菜不育系MSl和恢复系RF2杂交产生的F1代。4原理根据抗除草剂油菜MSl和RF2中PTA29启动子、MSl转化体特异性序列、RF2转化体
6、特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得266 bp、194 bp、200 bp的预期DNA片段，检测试样中是否含有PTA29启动子、抗除草剂油菜MSl和RF2。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5 1琼脂糖5 2 10 gL溴化乙锭(EB)溶液称取10 g溴化乙锭(EB)，溶解于100mL水中。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。53 10 molL氢氧化钠溶液称取800 g氢氧化钠(NaoH)，加160mL水溶解后，再加水定容到200mL。54 500 mmolL乙二铵四乙酸二钠溶液pH8 0)称取1869乙二铵四乙
7、酸二钠(EDTA-Na2)，加人70n1L水中，加入适量氢氧化钠溶液(53)，加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液调pH至80，用水定容到100 mL。在1034 kPa(121(2)条件下灭菌20min。55 1 molL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH80】称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸(HCl)调pH至80，加水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。56 TE缓冲液(pH8 0】分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，加水定容至1 000 mL。在1034
8、 kPa(121)条件下灭菌20 rain。57 50xTAE缓冲液称取2422 g三羟甲基氨基甲烷，加入300 mL水加热搅拌溶解后，加入100 mL L,-铵四乙酸二钠溶液(54)，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容到1 000mL。使用时用水稀释成1TAE。58加样缓冲液称取2500mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12 h；称取2500mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取500 g蔗糖，加30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4E下保存备用。59 DNA分子量标准可以清楚地区分50 bp1 000 bp的DNA片段。510 aNTes混合溶液将浓度为10 mm
9、olL的dATP、dTTP、dGTP、dCIP四种脱氧核糖核苷酸的等体积混合。2511 Taq DNA聚合酶(5U仙L)及PCR反应缓冲液5 12引物5 12 1 HMGIy基因。hmgF：5一TCCTTCCGllnCCTCGCC一3hnlg R：51”I、CCACGCCCTCTCCGCT 3预期扩增片段大小206 bp。5 12 2 PTA29启动子序列。PTA29一F：5一TAAGGl、(3G，I、(X)C1mACTA一3PI、A29一R：5一AC丌GCACCACAAGGGCATA一3预期扩增片段大小为266 bp。512 3 MSl转化体特异性序列。MSl一F：5。03GTGAGTAAT
10、ATTGTACGGCTAA一3MSlR：5 7一A，I_(了rGGTTa A 6Ca，ITCCA，IrTG一3预期扩增片段大小194 bp。5124 R砣转化体特异性序列。RF2一F：5一TTGGlmACCC，工1BAGGAAAC一3RF2一R：5CCATCTAATAGGGTGAGAC姐T一3预期扩增片段大小200 bp。513引物溶液。用TE缓冲液(56)分别将上述引物稀释到10,umolL。5 14石蜡油515 PCR产物回收试剂盒6仪器61重蒸馏水发生器或超纯水仪。62 PCR扩增仪。63电泳槽、电泳仪等电泳装置。6 4紫外透射仪。65凝胶成像系统或照相系统。66分析天平，感量01 mg
11、。67其他分子生物学实验仪器设备。7操作步骤71抽样按NYT 672和NYT 673规定执行。7 2制样按NYT 672和NYT 673规定执行。73试样预处理按NYT 674规定执行。74 DNA模板制备按NYT 674规定执行。农业部8(59号公告-6-2007农业部869号公告一6200775 P(m反应751试样PCR反应7511每个试样PCR反应设置三次重复。7 5 1 2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50“L石蜡油(有热盖设备的P(承仪可以不加石蜡油)。7 513将PCR管在台式离心机上离心i0 s后插入PCR仪中。7514进行PCR反应。反应程序为：
12、94变性5min；进行35次循环扩增反应(94变性30 s，58退火30 s，72延伸45 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长)；72延伸7min。7515反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1 PCR反应体系试 剂 终浓度 单样品体积无菌水 3175“L10xPCR缓冲液 l 5 uL25 mmolL氯化镁溶液 25 mn-DlL 5止dNTPs混合溶液 02 mmolL I“L10“molL上游引物 05“nlL 25“L10“molL下游引物 05 tanolL 25止5U仙Taq酶(热启动) 0025U札 025“L259LDNA
13、模板 I gL 20止总体积 50止如果10xPCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水；油菜内标准基因PeR检测反应体系中，上、下游引物分别为hrng-F和hmgR；PTA29启动子PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为PTA29一F和PTA29一R；MSI转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为MSl一F和MSIR；RF2转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为RF2一F和RF2一R。752对照PCR反应7521在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与751相同。7 5 22用非转基
14、因油菜材料提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板。7 523用含0iI抗除草剂杂交油菜MSlRF2基因组DNA的样品作为阳性对照PCR反应体系的模板。7524用无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。7 6 PCR产物电泳检测按209L的浓度称量琼脂糖加入1TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5止EB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。吸取7止PCR产物与3“L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2Vc
15、rn-5 Vcm条件下电泳。77凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估d农业部869号公告62007计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照78和79的规定执行。7 8 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。79 PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，并对测序结果进行比对和分析，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述81对照样品结果分析阳
16、性对照的PCR反应中，HMGIY内标准基因、基因表达调控元件PTA29启动子、Msl转化体特异性序列和RF2转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而在阴性对照中仅扩增出HMGIY基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作。否则重新检测。8 2试样检测结果分析和表述8 21卸G Iy内标准基因和基因表达调控元件PTA29启动子均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，结果分为4种情况：a)MSl转化体特异性序列得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，RF2转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期不一致，表明该样品检出抗除
17、草剂油菜MSl成分，表述为“试样中检测出抗除草剂油菜MSl成分，检测结果为阳性”。b)RF2转化体特异性序列得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，MSl转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期不一致，表明该样品检出抗除草剂油菜RF2成分，表述为“试样中检测出抗除草剂油菜RF2成分，检测结果为阳性”。c)MSl转化体特异性序列和RF2转化体特异性序列均得到了扩增，且扩增出的DNA片段大小与预期片段大小一致，表明该样品检出抗除草剂油菜MSl和RF2成分。表述为“试样中检测出抗除草剂油菜MSl和RF2成分，检测结果为阳性”。如需确定试样是否含杂交油菜MSlRF2，需进一步单
18、粒检测。如果单粒种子同时检测出抗除草剂油菜MSl和RF2成分，表明试样含杂交油菜MSl X RF2。表述为“试样中检测出抗除草剂杂交油菜MSlRF2成分，检测结果为阳性”。d)MSl转化体特异性序列和RF2转化体特异性序列没有得到扩增或扩增片段大小与预期不一致，表明该样品未检出抗除草剂油菜MSl和RF2，表述为“试样中检测出PTA29启动子、未检测出抗除草剂油菜MSl和RF2成分”。822仅有HMG IY内标准基因片段得到扩增，表明未检测出抗除草剂油菜MSl和RF2成分，表述为“试样中未检测出抗除草剂油菜MSl、RF2成分，检测结果为阴性”。823 HMG Iy内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，不作判定。
