1、ICS 67050X 04中华人民共和国国家标准农业部869号公告一82007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Btl 76及其衍生品种定性PCR方法Detection of Genetically Modified Plants and Derived ProductsQualitative PCR Method for Insect-resistant and Herbicide-tolerantMaize Btl76 and Its Derivates20070611发布 20070801实施中华人民共和国农业部发布刖 罱农业部869号公告一8-2007本标准由中华人民共和国农
2、业部提出。本标准归1：3全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农业部科技发展中心、吉林省农业科学院、上海交通大学、香港基因晶片开发有限公司、上海市农业科学院、山东省农业科学院。本标准主要起草人：张明、厉建萌、杨立桃、李飞武、刘乐庭、刘信、潘爱虎、路兴波、付仲文、李葱葱。农业部869号公告一82007转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Btl76及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因抗虫和耐除草剂玉米Btl76的转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因抗虫和耐除草剂玉米Btl76及其衍生品种，以及制品中Btl76的定性PCR检测。2规范性引用文
3、件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31zSsIlrb基因zSSlIb gene编码玉米淀粉合酶异构体zSTS lI一2的基因。3 2Btl76转化体特异性序列eventspecific sequen
4、ce of Btl76外源插入片段3 7端与玉米基因组的连接区序列，包括bar终止子3端部分序列和玉米基因组的部分序列。4原理根据转基因抗虫和耐除草剂玉米Btl76转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期570 bp的DNA片段，检测试样中是否含有Btl76。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。51琼脂糖。52 10 gL溴化乙锭溶液：称取10 g溴化乙锭(EB)，溶于100mL水中。注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。53 10molL氢氧化钠溶液：称取800 g氢氧化钠(NaOH)，先用160mL水溶解后，再
5、加水定容至200mL。54 500mmolL乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 80)：称取1869乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2)，加入1农业部869号公告一8200770mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液(53)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(53)调pH至80，加水定容至100 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 min。55 1 molL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH 80)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800mL水中，用盐酸调pH至80，加水定容至1 000mL。在1034kPa(121)条件下灭菌20rain。56 TE缓冲液(pH8
6、0)：分别量取10n1L三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，加水定容至1 000mL。在1034 kPa(121(2)条件下灭菌20rain。5 7 50TAE缓冲液：称取24229三羟甲基氨基甲烷，先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mL乙二铵四乙酸二钠溶液(54)，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容至1 000 mL。使用时用水稀释成1TAE。5 8加样缓冲液：称取2500mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12 h；称取2500mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取500 g蔗糖，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4下保
7、存。59 DNA分子量标准：能够清楚地区分50 bp1 000 bp的DNA片段。510 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmolL的dATP、d1曙、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。511 TaqDNA聚合酶(5 uL)及PCR反应缓冲液。512引物。5 12 1 zSSIIb基因。zSSIIbF：5-CGGTGGATGCTAAGATG-3；zSSIIb-R：5-AAAGGGCCAGGlrCATTAlC俯3；预期扩增片段大小为88 bp。5122 Btl76转化体特异性序列。Btl76一F：5 7一AAGCACGGTCAACl1：CGTAC一3；Btl76一Rt5-1嗡蜒m
8、吼黼G瞄嗨3一、预期扩增片段大小为570 bp。5 13引物溶液：用TE缓冲液(56)分别将上述引物稀释到10衅nolL。5 14石蜡油。5 15 PcR产物回收试剂盒。6仪器61分析天平，感量01mg。62 PCR扩增仪。63电泳槽、电泳仪等电泳装置。6 4紫外透射仪。65凝胶成像系统或照相系统。6 6重蒸馏水发生器或超纯水仪。67其他分子生物学实验室仪器设备。7操作步骤71抽样按NYT 672和NYT 673规定执行。2农业部869号公告一820077 2制样按NYT 672和NYT 673规定执行。73试样预处理按NYT 674规定执行。7 4 DNA模板制备按NYT 674规定执行。7
9、 5 PCR反应751试样PCR反应75 11每个试样PCR反应设置3次重复。7512在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50止石蜡油(有热盖设备的PCR仪可以不加)。7513将PCR管在台式离心机上离心10 s后插入PCR仪中。7514进行PCR反应。反应程序为：94变性5min；进行35次循环扩增反应(94变性30 s，58退火30 s，72*(2延伸40 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长)；72延伸7min。751 5反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物进行电泳检测。表1 PCR检测反应体系试 剂 终浓度 体 积无菌水 3
10、175uL10PCR缓冲液 l 5t*L25 mmolL氯化镁溶液 25 mn劬lL 5止clNTPs混合溶液 02 retoolL 1止10ttrnolL上游引物 05 umolL 25“L10tmiolL下游gI物 05 vmolL 25 uL5 u止Taq酶 0025 uuL 025“L25 rngL DNA模板 1mgL 20 uL总体积。50uL注1：如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。注2：玉米内标准基因PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为z隅lltrF和zSSIIb-R；转基因玉米Btl76转化体PCR检测反应体系中，上、下游引物分别为Btl76一
11、F和Btl76一R。752对照PCR反应7521在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与751相同。7522以非转基因玉米DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板。7523以Btl76含量为011的玉米中提取的DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板。7524以无菌水作为空白对照PCR反应体系的模板。7 6 PCR产物电泳检测按20 gL的浓度称取琼脂糖加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5f*LEB溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝
12、固成凝胶后，放人1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7”L PCR产物与3”L加样3农业部869号公告一82007缓冲液混合后加入凝胶点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2 Vcra-5 Vcm条件下电泳。7 7凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照78和79的规定执行。78 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的
13、DNA片段。79 PCR产物测序验证将回收的PCR产物克隆测序，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述81对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，zSSIIb内标准基因、转化体特异性序列均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出zSSIIb基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。82试样检测结果分析和表述a)zSSIIb内标准基因、转化体特异性序列均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出转基因玉米Bt 176，表述为“试样中检测出转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt176，检测结果为阳性”。b)zSSIIb内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出转基因玉米Bt176，表述为“试样中未检测出转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt 176，检测结果为阴性”。c)zSSIIb内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，不作判定。4
