1、ICS 65020B 04中华人民共和国国家标准农业部953号公告一42007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Oxy一235及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and deHved productsQualitative PCR method for herbicide-tolerant canola Oxy-235 and its derivates20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 舌农业部953号公告一42007本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。本标准由全国农业转基因
2、生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部科技发展中心、上海交通大学、上海市农业科学院。本标准主要起草人：杨立桃、宋贵文、张大兵、潘爱虎、刘信。本标准为首次发布。农业部953号公告一42007转基因植物及其产品成分检测耐除草剂油菜Oxy一235及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂油菜Oxy-235转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因耐除草剂油菜0xy-235及其衍生品种，以及制品中Oxy一235的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订
3、版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求NYT 673转基因植物及其产品检测抽样NYT 674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31、ItMGIY基因HMGVY gene编码高移动簇蛋白IY的基因。320xy-235转化体特异性序列event_specific sequence of 0xy-235外源插人片段5端与油菜基因组的连接区序列，包括CaMV 35 S启动子51端部分序列和油菜基因组的部分序列。4原理
4、根据转基因耐除草剂油菜Oxy-235转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期331 bp的特异性DNA片段，判断试样中是否含有转基因耐除草剂油菜Oxy一235。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5 1琼脂糖。5 2 10 gL溴化乙锭溶液：称取10 g溴化乙锭(EB)，溶于100mL水中。注：演化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。53 10 molL氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠(NaOH)800 g，先用160 mL水溶解后，再加水定容到200mL。1农业部953号公告一420075 4 500mmolL乙二铵四乙
5、酸二钠溶液(pH8o)：称取186 g乙二铵四乙酸二钠(EDTANa2)，加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液(53)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(53)调pH至80，加水定容至100 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。55 1toolL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH8o)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Trls)溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至80，加水定容至1 000 mL。在103。4 kPa(121)条件下灭菌20 rain。5 6 TE缓冲液(pH8o)：分别量取lo mL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(55)和2 mL乙二铵四
6、乙酸二钠溶液(54)，加水定容至1 000 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。5 7 50XTAE缓冲液：称取2422 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，先用300 mL水加热搅拌溶解后，加100 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(5，4)，用冰乙酸调pH至80，然后加水定容到1 000 mL。使用时用水稀释成1TAE缓冲液。58加样缓冲液：称取2500mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12 h；称取2500mg二甲基苯腈蓝，用lomL水溶解；称取500 g蔗糖，用30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至i00mL，在CC下保存。59 DNA分子量标准：可以清楚地区分50
7、bp1 000 bp的DNA片段。510 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmolL的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。511 Taq DNA聚合酶(5 uffL)及PCR反应缓冲液。5 12引物。5 121 HMGIY基因。hragF：5一TCCTTCCGTTTCCTCGCC一3；hragR：5一TTCCACGCCCTCTCCGCT一3；预期扩增片段大小206 bp。5 12 2 Oxy一235转化体特异性序列。Oxy 235一F：5TTTGTTTATTGCTTTCGCC 3；Oxy一235一R：5一CCAGGGGATTCAGTTGGA 3；预期扩增片
8、段大小为331 bp。5 13引物溶液。用TE缓冲液(56)分别将上述引物稀释到10 pmolL。514石蜡油。5 15 PCR产物回收试剂盒。6仪器61分析天平，感量01mg。6 2 PCR扩增仪。6 3电泳槽、电泳仪等电泳装置。6 4紫外透射仪。65凝胶成像系统或照相系统。6 6重蒸馏水发生器或超纯水仪。6 7其他分子生物学实验室仪器设备。7操作步骤7 1抽样2农业部953号公告一42007按NYT 672和NYT 673规定执行。72制样按NYT 672和NYT 673规定执行。7 3试样预处理按NYT 674规定执行。74 DNA模板制备按NYT 674规定执行。7 5 PCR反应7
9、5 1试样PCR反应7 5 1 1每个试样PCR反应设置三次重复。7 5 1 2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50“L石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。7 5 1 3将PCR管放人台式离心机中离心10 s后插入PCR仪中。7514运行PCR反应。反应程序为：95。C变性5 min；进行35次循环扩增反应E94 oc变性30 s，52。C(Oxy一235转化体特异性序列)或58C(HMG IY)退火30 s，72延伸30 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当调整；72C延伸7 min。7515反应结束后取出PCR反应管，对PCR反应产物
10、进行电泳检测。表1 PCR检测反应体系试 剂 终浓度 体 积无菌水 317S“L10PCR缓冲液 1 5 gL25 retoolI，氯化镁溶液 2 5 rnmolL 5tzLdNTPs O2 retoolL 1ttL10 izmoL上游引物 O5 umolL 25 uI。10 tanolL下游引物 05 ttmolI， 2 5 uL5UuL Taq酶 0025UpI。 0 25 uI，25 mgI，DNA模板 1ragL 2 0止总体积 50“L注：1如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。2油菜内标准基因PCR检测反应体系中，上下游引物分别为hmgF和hrng R；转
11、基因油菜Oxy 235转化体PCR检测反应体系中，上下游引物分别为Oxy 235 F和Oxy一235一R。752对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照，各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与751相同。以非转基因油菜材料中提取的DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板；以Oxy 235油菜DNA含量为011o的油菜DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板；空白对照中用无菌水代替PCR反应体系模板。7 6 PCR产物电泳检测按20 gL的浓度称取琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。按每100 mL琼脂糖溶液中加入5 pI，E
12、B溶液的比例加入EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放人1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7“L PCR产物与3“L加样缓冲液混合后加入点样孔中，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2 Vcm5 VClTI条件下电泳。7 7凝胶成像分析3农业部953号公告一42007电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照78和79
13、的规定执行。7 8 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。7 9 PCR产物的测序验证将回收的PCR产物克隆测序，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述8 1对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，HMG IY内标准基因和转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出HMG IY基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。82试样检测结果分析和表述a)HMG IY内标准基因和转化体特异性序列均得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出转基因耐除草剂油菜Oxy一235，表述为“试样中检测出转基因耐除草剂油菜Oxy一235，检测结果为阳性”。b)HMG IY内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而转化体特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出转基因耐除草剂油菜Oxy一235，表述为“试样中未检测出转基因耐除草剂油菜Oxy一235，检测结果为阴性”。c)HMG IY内标准基因片段未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出油菜成分，表述为“试样中未检测出油菜成分，检测结果为阴性”。
