1、ICS 6712030B 52中华人民共和国国家标准农业部953号公告一52007转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法Detection of genetically modified animals and derived productsQualitative PCR method for growth promoting common carp20071218发布 200803一01实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部953号公告一52007本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。本标准起草单位：农
2、业部科技发展中心、中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。本标准主要起草人：梁利群、历建萌、孙效文、沈平、闰学春、常玉梅。本标准为首次发布。1范围农业部953号公告-5-2007转基因动物及其产品成分检测促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法本标准规定了转ScGH基因促生长鲤鱼基因特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转ScGH基因促生长鲤鱼中转基因成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注
3、日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 186542养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法NYT 672转基因植物及其产品检测通用要求ScT 3016水产品抽样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1cytb基因cytb gene编码鲤鱼细胞色素b的基因。3 2ScGH基因ScGH gene大麻哈鱼生长激素基因。4原理针对转ScGH基因促生长鲤鱼含有的ScGH基因序列，设计基因特异性引物进行PCR扩增，以检测试样中是否含有ScGH基因。5试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。对实验室的要求按NYT 672执行。5 1 TaqDNA聚合酶(5u“I。)及PCR反应缓冲
4、液(含25mmolLMg”)。5 2 DNA分子量标准：能够区分50 bp1 000 bp的DNA片段。5，3 dNTPs混合溶液：将浓度为10 mmolL的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5 4氯仿：异戊醇(24：1，v”)。5 5酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，口口)。56琼脂糖。57 10 gL溴化乙锭溶液：称取10 g溴化乙锭(EB)，溶于100mL水中。1农业部953号公告一52007注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5 8 10molL氢氧化钠溶液：称取800 g氢氧化铺(NaOH)，加入160mL水中完全溶解，
5、加水定容至200ml。5 9 500mmolL乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 80)：称取186 g乙二铵四乙酸二钠(EDTANa2)，加入70mL水中，再加入适量氢氧化钠溶液(58)，加热至完全溶解后，冷却至室温，用氢氧化钠溶液(58)调pH至80，加水定容至100 mL。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 rain。5 10 1 toolL三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(pH 8O)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至80，加水定容至1 L。在1034 kPa(121。C)条件下灭菌20 rain。51 1 1 molL三羟甲基氨基甲烷一盐酸
6、溶液(pH 75)：称取1211 g三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至7s，加水定容至1 L。512 TE缓冲液(pH 8o)：分别量取10 mI。三羟甲基氨基甲烷一盐酸溶液(510)和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(59)，加水定容至1 L。在1034 kPa(121)条件下灭菌20 min。5 13 TE缓冲液(pH 75)：分别量取10 mL三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(511)和2 mL乙二铵四乙酸二钠溶液(59)，加水定容至l L。在103。4 kPa(121。C)条件下灭菌20 rain。514 5TBE缓冲液：称取54 gTris，275 g硼酸，加50
7、0mL水搅拌溶解后，加入20mL乙二铵四乙酸二钠溶液(59)，然后用水定容到1 L。515加样缓冲液：称取2500mg溴酚蓝，加10mL水，在室温下溶解12 h；称取2500mg二甲基苯腈蓝，用10mL水溶解；称取500 g蔗糖，用30mL水溶解。混合三种溶液，加水定容至100mL，在4下保存。5 16 DNA裂解液：05molLEDTA(pH 80)，200ragI。蛋白酶K(ProteinaseK)，05十二烷基硫酸钠(SDS)。5 17透析液：50 mL 1 molL三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液(510)，20 mI，500 rmnolI乙二铵四乙酸二钠溶液(59)，加水定容至1 L。5 1
8、8 1 ragmI。无DNA的RNA酶：将2 mg RNA酶A溶于2 mL TE(513)中，于100|。C加热15 rain，缓慢冷却至室温，保存于20。5 19 70乙醇溶液：取700 mI。无水乙醇，加水定容至1 L。5 20引物5 201 ScGH基因。GHF：5一AGGATGAAACGGGTGGGT 3+；GHR：5一GCnTAGGAGGTCGCCAAAA 3；预期扩增片段152 bp。5 202 cytb基因。L：5一GACTTGAAAAACCACCGTTG一3；H：5CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC 3；预期扩增片段475 bp。5 21引物溶液：用1TE缓冲液(51
9、2)分别将上述引物稀释到25 pmolL。6仪器61 PCR扩增仪。62电泳槽、电泳仪等电泳装置。63凝胶成像系统或紫外透射仪。2农业部953号公告一520076 4重蒸馏水发生器或超纯水仪。6 5其他分子生物学实验室仪器设备。7操作步骤7 1抽样按CBT 186542和scT 3016执行。72制样将待测样品(鱼肌肉、鳍条等组织)用消毒剪刀剪碎，颗粒大小在4 nm以下进行DNA提取。73 DNA模板制备7 3 1 DNA模板的提取将剪碎样品30mg放人15mL离心管中，加入300“LDNA裂解液，50。C消化过夜，加人等体积的酚：氯仿：异戊醇溶液，震荡混匀，室温2 500 g离心5rain，
10、吸取上层水相，重复抽提两次。将上清液转入透析袋中进行数次透析，直到透析液OD2，。o05，将透析袋中的液体转入离心管中，加入无DNA的RNA酶，终浓度为100mgL，37。C温浴30min。先用冰预冷的无水乙醇沉淀，4，15 000 g离心20 rain，弃上清液，用70乙醇洗涤沉淀，15 000 g离心，2次3次，室温干燥后加TE(pH 8o)溶解，并保存于4备用。7 3 2 DNA溶液纯度的测定和保存将DNA适当稀释，测定并记录其在260 nm和280 nm的紫外分光吸收率，以一个OD2。值相当于50mgLDNA浓度来计算纯化的DNA浓度。要求DNA溶液ODz。O耽。的比值在17-18之问
11、。依据测得的浓度将DNA溶液稀释至25 nagI，50 mgL，于20保存。注：由于基因组DNA不宜反复冻融，建议多管分装保存，融化后应立即使用。剩余的DNA应在4冰箱中短期保存，存放时间不宜超过14 d。74 PCR反应7 4 1试样的PCR反应7 4 1 1每个试样PCR反应设置三次重复。7 4 1 2在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂，用手指轻弹混匀，再加50止石蜡油(有热盖设备的PCR仪可以不加)。表1 PCR检测反应体系 单位为微升试剂 体积无菌水 18 310PCR缓冲液 2 5dNTPs混合溶液 125 tmaolI。上游引物 l25 tLmolL下游引物 15UI。Taq酶
12、 0 225 ragI。DNA模板 10总体积 25注：鲤鱼内标准基因PCR检测反应体系中上、下游引物分别为I。和H；ScGH基因PCR检测反应体系上、下游引物分别为GHF和GHR。7 4 1 3将PCR管在台式离心机上离心10 s后插入PCR仪中。7 4 1 4进行PCR反应。反应程序为：94。C变性3 min；进行35次循环扩增反应(93。C变性30 s，55。C(ScGH引物)或58。C(eytb引物)退火30 s，72。C延伸40 s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反3农业部953号公告一52007应的退火和延伸时间适当延长)；72延伸5 rain。74 15反应结束后取出PCR反
13、应管，对PCR反应产物进行电泳检测。7 4 2对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与741相同。以非转基因鲤鱼DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板；以转ScGH基因促生长鲤鱼材料中提取的DNA作为阳性对照PCR反应体系的模板；以无菌水代替空白对照PCR反应体系的模板。75 PCR产物的电泳检测按159L的浓度称取琼脂糖JJtk 05TBE缓冲液中，加热溶解。配制成琼脂糖溶液。按每100mL琼脂糖溶液中加入5 pL EB溶液的比例加入EB溶液，混匀，适当冷却后，将其倒人电泳板上，插上梳板，室温下凝固成
14、凝胶后，放人05TBE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取7 pLPCR产物与3止加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔中，其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源在2 Vcm5 VCEll条件下电泳。7 6凝胶成像分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。根据琼脂糖凝胶电泳结果，按照8的规定对PCR扩增结果进行分析。如需确认PCR扩增片段是否为目的DNA片段，按照77和78执行。77 PCR产物回收按PCR产物回收试剂盒说明书回收PCR扩增的DNA片段。78 PCR产物的测序验证将回收的PC
15、R产物克隆测序，确定PCR扩增的DNA片段是否为目的DNA片段。8结果分析与表述81对照样品结果分析阳性对照PCR反应中，cytb内标准基因和ScGH基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照中仅扩增出cytb基因片段，空白对照中没有任何扩增片段，表明PCR反应体系正常工作，否则重新检测。82试样检测结果分析和表述a)cytb内标准基因和ScGH基因均得到了扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明试样中检测出ScGH基因，表述为“试样中检测出ScGH基因，检测结果为阳性”。b)cytb内标准基因片段得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而ScGH基因未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明试样中未检测出ScGH基因，表述为“试样中未检测出ScGH基因，检测结果为阴性”。
