1、ICS 65020B 04中华人民共和国国家标准农业部953号公告一72007转基因植物及其产品环境安全检测育性改变油菜Evaluation of environmental impact of genetically modified plantsand its derived products Fertility-modified rape20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布前 言农业部953号公告72007本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归El。本部分起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究
2、所。本部分主要起草人：卢长明、宋贵文、武玉花、厉建萌、吴刚、肖玲。本部分为首次发布。农业部953号公告一72007转基因植物及其产品环境安全检测育性改变油菜1范围本标准规定了对改变育性的转基因油菜雄性不育系、恢复系及其杂种后代育性、生存竞争能力、外源基因漂移和生物多样性影响的检测方法。本标准适用于转基因油菜育性、生存竞争能力、外源基因漂移和生物多样性影响的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注El期
3、的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB 44072经济作物种子油料类NYT 721转基因油菜环境安全检测技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3 1育性改变油菜fertility altered rapeseed通过基因工程技术将影响育性的外源基因导入油菜基因组而培育出的油菜不育系、恢复系及其杂种后代。3 2花粉可染率pollen stainability成熟的新鲜花粉用1醋酸洋红染色后，可染色的正常花粉在观察的总花粉中所占比率。3 3不育性保持率maintained male-sterility转基因油菜不育系与常规品种杂交后，杂种群体中完全雄性不育单株所占比率。3 4不育性恢复
4、度restorability of restorer line to male-sterile line恢复系对雄性不育系的育性恢复程度。用转基因油菜不育系与恢复系杂交F。群体的自交结实性、恢复株率和不育株率表示。3 5异交率outcrossing rate改变育性的转基因油菜与非转基因油菜品种或相关近缘种自然杂交的比率。36基因漂移gene flow改变育性的转基因油菜中的外源基因通过花粉向油菜栽培品种或相关近缘种自然转移的行为。1农业部953号公告一720074要求试验材料的质量应达到GB 44072中对油菜生产用种的要求。资料记录和实验安全控制措施按NYT 7211的要求执行。5育性检测
5、51转基因油菜不育系511试验材料转基因油菜不育系；转基因油菜不育系与3个非转基因油菜常规品种的杂种F。以育性正常的非转基因油菜品种作为花粉育性正常的对照(CKl)，波里马雄性不育系作为花粉败育的对照(CK2)。5 1 2检测内容花粉可染率、自交结实性和不育性保持率。513试验设计随机区组设计，3次重复，小区面积为6 m2，株距、行距分别为20 crn和40 cm。51 4田间管理按当地常规栽培管理方法进行。5 1 5花粉可染率检测在油菜盛花期，从转基因油菜不育系、CKl及CK2小区各选择典型单株10株，每株取刚开放的2朵花，从花朵中取出花药，置于载玻片中央，滴加一滴1醋酸洋红，用镊子和解剖针
6、释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数。每朵花观察500粒花粉左右。5 1 6自交结实能力检测从转基因油菜不育系、CKl及CK2的各小区分别选择30个单株，对主花序(去除开过花和正在开花的花朵以及幼小的花蕾后保留20个花蕾)进行套袋自交，调查每荚结实粒数。51 7不育性保持率检测从CKl、CK2和3个F，杂种的各小区分别选择30个单株，对主花序(去除开过花和正在开花的花朵以及幼小的花蕾后保留20个花蕾)进行套袋自交，调查每荚结实粒数。518结果分析5 1 8 1不育性分析分别计算转基因油菜不育系、CKl及CK2花粉可染率总平均数和每个材料三次重复的平均数的标准差；分
7、别计算转基因油菜不育系、CKl及CK2自交后每荚结实粒数总平均数和每个材料三次重复的平均数的标准差。在CKl正常可育和CK2正常不育的前提下，通过t测验，分析转基因油菜不育系的花粉可染率和每荚结实粒数与CKl和CK2是否存在显著差异。如果花粉可染率和自交后每荚结实粒数均显著小于CKl，表示雄性不育性显著；如果花粉可染率和自交后每荚结实粒数等于或小于CK2，则表明雄性不育性彻底；如果花粉可染率与CKl无显著差异，而自交后每荚结实粒数显著低于CKl，表明具有自交不亲和性；如果花粉可染率和自交后每荚结实粒数与CKl无显著差异，表明花粉可育。5 18 2不育性保持率分析计算CKl、CK2和3个F。杂种
8、每个自交单株的每荚平均结实粒数；在CKl结实正常、CK2正常不育的前提下，计算杂种F，中每荚平均结实粒数低于或等于CK2的自交单株所占比率(不育性保持率)。通过x2测验分析不育性保持率与理论值(1：1)是否存在显著差异。如果x2测验结果表明3个F，杂种都与理论值(1：1)没有显著差异，表明不育性被稳定保持，且呈细胞核单基因稳定遗传。5 2转基因油菜恢复系2农业部953号公告72007521试验材料转基因油菜恢复系与转基因油菜不育系的杂交种(F1)，转基因油菜恢复系，以育性正常的非转基因油菜品种作为花粉育性正常的对照(CKl)，波里马雄性不育系作为花粉败育的对照(CK2)。5 2 2检测内容花粉
9、可染率、自交结实能力和不育株率。523试验设计随机区组设计，3次重复，小区面积为4 m，株距、行距分别为20 cm和40 cm。5 24田间管理按当地常规栽培管理方法进行。52 5花粉可染率检测在油菜盛花期，从转基因油菜恢复系、CKl及CK2小区各选择典型单株10株，按本标准515的方法观察，计数可染色花粉数和花粉总数。每朵花观察500粒花粉左右。52 6自交结实性和不育株率检测从521中的杂交种(F。)、CKl和CK2的各小区分别选择30个油菜单株，对主花序(去除开过花和正在开花的花朵以及幼小的花蕾后保留20个花蕾)进行套袋自交，调查每荚结实粒数。5 2 7结果分析527 1恢复系花粉育性分
10、析分别计算转基因油菜恢复系、CKl及CK2花粉可染率总平均数和每个材料三次重复的平均数的标准差；分别计算转基因油菜恢复系、CKl及CK2自交后每荚结实粒数总平均数和每个材料三次重复的平均数的标准差。在CKl正常可育和CK2正常不育的前提下，通过t测验，分析转基因油菜恢复系的花粉可染率和每荚结实粒数与CKl是否存在显著差异。如果花粉可染率和自交后每荚结实粒数与CKl无显著差异，表明恢复系花粉正常可育；如果花粉可染率与CKl无显著差异，而自交后每荚结实粒数显著低于CKl，表明恢复系具有自交不亲和性；如果花粉可染率和自交后每荚结实粒数均显著小于CKl，表示恢复系花粉育性偏低。5272不育性恢复度分析
11、分别计算CKl、CK2和F-杂种每个自交单株的平均每荚结实粒数，在CK结实正常、CK2正常不育的前提下，计算杂种F-自交单株中每荚平均结实粒数低于或等于CK2的单株所占比率(不育株率)。根据不育株率的高低判断恢复基因表达的稳定性。分别计算CKl、CK2和Ft杂种每荚结实粒数的总平均数和每个材料三个重复的平均数的标准差。通过t测验分析，若杂交种(F1)每荚结实粒数不显著低于CKl，表明恢复系具有良好恢复能力；若杂交种(F。)每荚结实粒数显著低于CKl，表明恢复系恢复能力不良。6生存竞争能力检测6 1试验材料转基因油菜(转基因油菜不育系、转基因油菜恢复系或其杂交种)、受体油菜品种和当地常规油菜品种
12、。6 2检测方法按NYT 7211的“4试验方法”执行。6 3结果分析用方差分析方法比较各品种生存竞争能力的差异。3农业部953号公告一720077外源基因漂移检测71异交率检测71 1试验材料花粉供体为转基因油菜(转基因油菜恢复系或杂交种)，花粉受体为1个常规油菜品种、1个油菜不育系、6个油菜近缘种(3种不同类型白菜、3种不同类型芥菜品种)。7 1 2试验设计随机区组设计，4次重复。花粉受体品种两边各种一行花粉供体组成一个组合，每个组合之间问隔一行。行长5m，行距40 CITI，株距20 cm。7 1 3播种播种时间冬油菜区为lo月1日前后5 d，春油菜区为3月15日前后5 d。播种量冬油菜
13、区为042 gm2，春油菜区为06 gm2。根据非转基因物种与转基因油菜生育期调整播种期，使花期相遇时间不少于80。714田间管理按当地常规栽培管理方法进行。7 15调查方法按NYT 7212中514执行。71 6检测方法按NYT 7212中515执行。7 17结果表述按NYT 7212中516执行。718结果分析根据异交率平均数与标准差大小，判断转基因油菜与花粉受体品种异交可能性的大小。72基因漂移距离和频率的检测按照NYT 7212中52执行。8对生物多样性影响的检测8 1试验材料转基因油菜(转基因油菜不育系，转基因油菜恢复系或杂交种)，对应的非转基因油菜品种。8 2试验设计按NYT 72
14、13中51执行。83播种按NYT 7211中432执行。84田间管理按NYT 7213中53执行。8 5对油菜病害的影响8 5 1调查方法按NYT 7213中551执行。8 5 2结果表述按NYT 7213中542执行。86对油菜田节肢动物多样性的影响4农业部953号公告一720078 61调查方法按NYT 7213中551执行。86 2结果记录记录所有直接观察到和用吸虫器抽取的节肢动物的名称、发育阶段和数量。86 3结果分析用方差分析方法分析比较转基因油菜与其他油菜对主要害虫及天敌种群数量以及主要病害的影响。用节肢动物群落的多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数3个指标，分析比较改变育性的转基因油菜田及其他油菜田节肢动物群落的稳定性。节肢动物群落的多样性指数按公式(1)计算。H=一P，|nP。(1)l一1式中：H多样性指数；P。NiN；N。第i个物种的个体数；N总个体数；S物种数。计算结果保留2位小数。节肢动物群落的均匀性指数按公式(2)计算。JHlnS(2)式中：J均匀性指数；H_一多样性指数；s物种数。计算结果保留2位小数。节肢动物群落的优势集中性指数按公式(3)计算。C一(MN)2式中：c优势集中性指数；Nr一第i个物种的个体数；N总个体数。计算结果保留2位小数。(3)
