1、ICS 67050B 50中华人民共和国国家标准农业部958号公告一102007水产品中雌二醇残留量的测定气相色谱一质谱法Determination of estradiol residues in fishery productsGas chromatography-mass spectrometry method20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 旨农业部958号公告一102007本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。本标准起草单位：中国海洋大学。本标准主要起草人：林洪
2、、江洁、徐杰、邹龙、曹立民。1范围农业部958号公告一102007水产品中雌二醇残留量的测定气相色谱一质谱法本标准规定了水产品中p一雌二醇残留量的气相色谱质谱测定方法。本标准适用于水产品可食部分中8一雌二醇残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理酸性条件下，以乙腈提取样品中的B一雌二醇，经过正己烷脱脂，C
3、，e固相萃取柱净化，硅烷化试剂衍生化后，用气相色谱一质谱仪测定，内标法定量。4试剂41所有试剂应无干扰峰，除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水符合GBT 6682一级水指标。42 B一雌二醇标准品：纯度97。43 8一雌二醇一D2标准品：纯度98。4 4乙腈：色谱纯。45甲醇：色谱纯。46正己烷：色谱纯。47正丙醇。48乙酸钠缓冲溶液(o2 molL，pH 52)：取02 molL乙酸钠溶液237 mL和02 molI，乙酸溶液63 mL，混匀，用冰乙酸调至pH 52。49乙酸溶液(o1)：取025mL冰乙酸，加水溶解，定容至250mL。410 8一雌二醇标准贮备溶液：准确称取B一雌二醇001
4、 g，用甲醇溶解，定容于100mL容量瓶中，使成浓度为100gmL的标准溶液，一18存放，存放时间不超过6个月。411 D一雌二醇一D2内标贮备溶液：准确称取p一雌二醇D2001 g，用甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，使成浓度为200 tgmL的标准溶液，一18存放，存放时间不超过6个月。412 p一雌二醇标准工作溶液：临用前，准确吸取D一雌二醇标准贮备溶液，用甲醇稀释成浓度为0005“gmLo25 tgmI标准工作液，4。C暂时存放。413 0雌二醇一n内标工作溶液：临用前，准确吸取内标标准贮备溶液，用甲醇稀释成浓度为005 lugm珠准工作液，4。C暂时存放。414衍生化试剂：准确称取0
5、01 g二硫赤藓糖醇(DTE)，溶解于5mI。N一甲基三甲基硅基三氟乙酰1农业部958号公告一102007胺(MSTFA)，然后在液面下加入10”L三甲基碘硅烷(TMIS)，混匀，4。C放置过夜后使用，避光防潮密封保存。衍生化试剂应是无色，如果发生棕红色等颜色变化，表明试剂失效。5仪器5 1气相色谱单四极杆质谱联用仪：配备电子轰击电离(EI)离子源。52电子天平：感量00001 g。53旋涡混合器。54高速冷冻离心机：最大转速lO ooo rrain。5，5固相萃取仪。5 6氮吹仪。57具塞离心管：50 mL。58鸡心瓶；50mL。5。9具塞刻度玻璃管：10 mL。510固相萃取柱；填料500
6、mg，3mL，选用CleanertODSC，。(封端)，或相当者。511样品反应瓶：2 mL，去活，螺纹口。6测定步骤61样品预处理取水产品可食部分，切为不大于05 cm05 cm05 cm的小块后混匀，充分匀浆，冷冻保存备用。62提取称取样品5 g(精确到001 g)于50 mL具塞离心管中，加入100“L内标工作溶液。再加入5 mL乙酸钠缓冲溶液(48)，均质1 min后，加入10 mL乙腈，旋涡混合1 min，超声提取15 min。取出离心管，10 000 rmin 4离心10rain，上清液倒入另一50mL具塞离心管中。残渣中加入10mL乙腈，按上述方法再提取一次，上清液合并于50 m
7、L离心管中。注：均质机清洗方法，先用大量水浸洗，再用乙腈浸洗，最后用蒸馏水浸洗。63脱脂向盛装上清液的离心管中加入10“。正己烷，加塞剧烈振荡1min2min，10 000rmin4离心5 min，用滴管吸弃上层正已烷层。再加入10 mL正己烷，按上述方法重复洗涤一次，所得溶液转移至鸡心瓶，加入o5 mI，正丙醇，摇匀，于45水浴条件下减压旋转蒸发至于。残渣中加人1 mL乙腈，超声波清洗瓶壁1 rain后，用5 mL注射器吸取，重复上述操作，合并乙腈至5 mL注射器，用针头过滤器经有机系滤膜过滤至10 mL具塞刻度玻璃管中，加水至10 mL，旋涡混匀。64 c”柱净化c”固相萃取柱，顺序用6
8、mL甲醇、3 mL乙酸溶液(49)和3 mL水清洗并活化，弃掉洗涤液。吸取待测溶液(63)过柱，弃掉流出液。用3 mL水洗涤c。s柱，弃掉流出液。再用9 mL乙腈洗脱，将洗脱液接收至10 mL玻璃管中，于50。C下氮气吹至约1 mL，用滴管吸至样品反应瓶中，用05 mL乙腈洗玻璃管，合并至同一样品反应瓶中，氮气吹干，应防潮。注意：以上步骤应连续做完，不应让吸附剂变干，过柱的流速保持1 mLmin2 mLmin。6 5衍生化6 5 1试样的衍生化向吹干的残留物中准确加入100“L衍生化试剂(414)，盖紧塞子并旋涡混合1 rain，在60。C烘箱中2农业部958号公告一10_2007反应30 r
9、ain，冷却至室温，于48 h内进行气相色谱一质谱分析。652标准溶液的衍生化吸取一定量的8一雌二醇标准工作溶液和100肛L内标标准工作溶液于样品反应瓶中，氮气吹干，以下按651的步骤操作。66测定661色谱条件色谱柱：DB一5MS石英毛细管柱，固定相(5苯基)一甲基聚硅氧烷，25m032iTlrn052“m；或与之相当的色谱柱。载气：高纯氦气，纯度99999，流速10mLmin。进样口温度：250。进样方式及进样量：不分流进祥，l“L。升温程序：初始柱温120，保持2rain，然后以15rain，升至250，再以5Crain升至300，保持5min。662质谱条件离子源：EI源，电离能量70
10、 eV。离子源温度：230。四极杆温度：150。接口温度：280。溶剂延迟：3 rain。扫描质量范围：40 amu500 amu。选择离子监测(SIM)：口一雌二醇衍生物(mz)：416、326、285、232；B一雌二醇一功衍生物(mz)：418、328、287、234。663气相色谱一质谱分析6631定性方法样品峰与标准的保留时间之差不多于0i0 rain，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的特征离子均出现，并且样品峰的各选择离子相对强度与标准相应选择离子相对强度相一致时(参见附录图A1、A2)，可以判断检出口一雌二醇。在661和662规定的条件下，p一雌二醇和内标p一雌二醇一D2衍
11、生物的特征离子、特征离子相对强度和允许相对偏差应符合表1要求。表1 p一雌二醇和p。雌二醇D2衍生物的特征离子、特征离子相对强度和允许相对偏差特征离子 相对强度 允许相对偏差名称 416 100285 74 士10BEstradiol-(OTMS)2232 24 士15326 12 20418 100287 80 土10B Estradio一n一(OTMS)2234 22 土15328 10 士206 63，2定量方法农业部958号公告一10-2007以口一雌二醇衍生物定量离子(mz 416)与p一雌二醇一D2衍生物定量离-子(mz 418)质量色谱图(见附录图A3)雕j峰面积比单点或多点校准
12、定量。当单点校准定量时根据样品溶液中口一雌二醇含量情况，选择峰面积相近的标准工作溶液进行定量，同时标准工作溶液和样品液中8一雌二醇响应值均应在仪器检测的线性范围之内。7计算样品中8一雌二醇的含量按公式(1)计算：X-丛睽焉幽(1)式中：X样品中8一雌二醇含量，单位为微克每千克(ugkg)；Cs标准工作溶液中p一雌二醇含量，单位为微克每毫升(pgmL)；A试样液中口一雌二醇与B一雌二醇一D2衍生物定量离子的峰面积比值；y样品最终体积，单位为毫升(mL)；As标准工作溶液中口一雌二醇与p一雌二醇一功衍生物定量离子的峰面积比值；m样品质量，单位为克(g)。8方法回收率本方法的回收率60。9方法检测限
13、本方法检测限：05”gkg。10方法精密度本方法相对标准偏差15。11 方法的线性范围本方法的线性范围：O005 pgmI。o25 pgmI。4Abundance17(X)0】6 00015 00014()0013 0001200011 000100009。08 0007 000605 0004 0003 0002 000l 0000附录A(资料性附录)农业部958号公告一1020074 6；559 瞄。m。h垤融j阻熵95no 24嫩48597 147 9326，Il“ 【T跫b31355卿饕籍 43C50图A1 p一雌二醇全扫描质谱图(特征离子mz：416，326，285，232；定量离子mz：416图A2 P一雌二醇一Dz全扫描质谱图(特征离子mz：418，328287，234；定量离子tnz：418)农业部958号公告一102007Abumdanee图A3 P一雌-iW(0 25pgmL)-与P一雌二醇一D2标准溶液(0 05l丑gmL)衍生物的定量离子的质量色谱图
