1、ICS 67050B 50中华人民共和国国家标准农业部958号公告一122007水产品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱法Determination of sulfonamide residues in aquatic productsHigh performance liquid chromatography20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 富农业部958号公告一122007本标准附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。本标准起草单位：农业部水产品质量监督检验测试中心(上海)、
2、农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心(舟山)。本标准主要起草人：郑斌、蔡友琼、于慧娟、陈伟斌、黄冬梅、陈雪昌、毕士川、钱蓓蕾。1范围农业部958号公告一122007水产品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱法本标准规定了水产品中14种磺胺类药物残留量的测定方法：液相色谱一紫外检测法、液相色谱一柱后衍生荧光检测法。本标准规定了水产品中磺胺(sulfanilamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺噻唑(sulfathiazole)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、磺胺5一甲氧嘧啶(sulfameter)、磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine)、磺胺甲氧哒嗪(s
3、ulfamethoxypyridazine)、磺胺氯哒嗪(sulfachlorpyridazine)、磺胺6一甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺甲基异嚼唑(sulfamethoxazole)、磺胺多辛(sulfadoxine)、磺胺异曙唑(sulfafurazole)、磺胺二甲氧哒嗪(sulfadimethoxine)、磺胺喹嘿啉(sulfaquinoxaline)残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可
4、使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3液相色谱一紫外检测法3 1原理样品中残留的磺胺类药物用乙酸乙酯提取，旋转蒸发至近干，甲醇溶解，正己烷脱脂，固相萃取柱净化，甲醇洗脱后旋转蒸发至干，用流动相定容，反相色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。32试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GBT 6682一级水的标准。3 2 1标准品：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5一甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6甲氧嘧啶、磺胺甲基异噫唑、磺胺多辛、磺胺异嗯唑、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺喹嚼啉
5、，纯度均大于98OX。3 2 2乙酸乙酯。323正己烷。324乙腈：色谱纯。325甲醇：色谱纯。326冰乙酸：优级纯。3 2 7无水硫酸钠：经650灼烧4 h，置于干燥器内备用。328 1(vv)乙酸溶液：取冰乙酸5oo mL，加水稀释至500 mL。329 2(VV)乙酸溶液：取冰乙酸20oo mL，加水稀释至1 000 mI。3 2 10标准储备液：称取各磺胺标准品10 mg(精确至001 mg)，用甲醇分别溶解并定容至lo mL，各磺胺标准储备液浓度为1 000 mgL。避光冷藏保存，保存期为1个月。3 2 11混合标准中间液：适量移取各标准储备液(3210)，用甲醇稀释并定容至10 m
6、L，在室温下混农业部958号公告一12-2007匀。其中磺胺嘧啶40 ragL、磺胺噻唑40 ragL、磺胺甲基嘧啶40 mgI。、磺胺5甲氧嘧啶40 mgL、磺胺二甲基嘧啶40 mgL、磺胺甲氧哒嗪40 ragL、磺胺氯哒嗪40 mgL、磺胺6一甲氧嘧啶40 ragL、磺胺甲基异嗯唑40 nagL、磺胺多辛40 mgL、磺胺异嘿唑40 mgL、磺胺二甲氧哒嚎40 mgL、磺胺喹嘿啉80 mgL。避光冷藏保存，保存期为1周。3212混合标准使用液：取混合标准中间液5 mL，用甲醇稀释并定容至100 mL。现配现用。3213固相萃取柱：60mg3mL HLB(二乙烯基苯N一乙烯基吡咯烷酮共聚物)
7、，或其他等同效果的固相萃取柱。33仪器与设备331液相色谱仪：配紫外检测器。332电子天平：感量00001 g。33 3电子天平：感量001 g。33 4高速组织捣碎机。3 3 5旋转蒸发仪。336均质机：14 000 rrain。337离心机：5 000 rmln。33 8旋涡混匀器。339马福炉。3310玻璃抽滤器。34色谱条件341色谱柱：ODS一柱，5“m，250mmX46mm(id)，或性能相当者。3 4 2柱温：40。c。343流动相：乙腈、甲醇和2乙酸溶液(329)，梯度洗脱参数见表1。344流速：o6mLmin。3 45检测波长：270 nlTl。346进样量：50“I，。表1
8、流动相梯度表时间 乙腈 甲醇 2“乙酸溶液111In 0 5 10 8515 5 10 8530 20 10 7045 20 10 70451 5 】O 8555 5 i0 8535分析步骤3 5 1样品制备鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾，去头、去壳、去肠线，取肌肉部分；样品切成不大于05 crux05 crux05 cnl的小块后混合。352提取将样品解冻，称取5009，置于50mL玻璃离心管。然后加人25mL乙酸乙酯，超声1mln，加入5 g无水硫酸钠，均质机14 000 rmin均质1rain，旋涡混匀1mln，3 000 rmin离心10min，将乙酸乙酯层小2心转移到100 mI梨
9、形瓶中。再向原离心管中加入25 mL乙酸乙酯，旋涡混匀1 min，3 000 rmin离心10min，将乙酸乙酯层合并于100mL梨形瓶中，于30水浴中减压浓缩至近干。353净化先用1 mL甲醇溶解上述残渣，再加入12 mL乙酸溶液，涡旋混匀，超声1 min，转移到新的50mL玻璃离心管中，再向梨形瓶中加入1mL甲醇和2mLl乙酸溶液。涡旋混匀，超声1min，转移到50mL玻璃离心管中。向玻璃离心管中加入8mL正己烷，涡旋混匀，3 000 rmln离心5min，弃上层正己烷层，再加入8 mL正己烷重复操作一次，下层加水6 mL稀释。HLB(3 mL)固相萃取柱先分别用3 mL甲醇和6mI。水处
10、理，处理完毕后，加入试样稀释液，再用3mL水和2mL 5甲醇淋洗，最后用10mI。甲醇洗脱。洗脱液30C减压浓缩至干，用l mL流动相(乙腈+甲醇+2乙酸溶液一5+10+85)定容，经iL径045“m微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。354色谱分析取50“L进样，记录峰高，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准品的保留时间定性，外标法定量。13种磺胺参考保留时间参见附录A。355工作曲线取13种磺胺类药物标准中间液，用流动相稀释成标准工作液。取50“L进样，以峰高为纵坐标，以标准样品中磺胺浓度为横坐标，绘制工作曲线。36计算样品中磺胺类药物残留量按公式(1)计算。x：cv(1) m式中：x样
11、品中磺胺类药物的含量，单位为微克每千克gkg)；C样品提取液中磺胺类药物的浓度，单位为微克每升(“gL)；v最终定容体积，单位为毫升(mL)；M样品质量，单位为克(g)。3 7方法检出限本方法检出限：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5一甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6一甲氧嘧啶、磺胺甲基异嘿唑、磺胺多辛、磺胺异嘿唑、磺胺二甲氧哒嗪为10pgkg；磺胺喹曙啉为20 pgkg。38方法回收率本方法回收率70。3 9精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的相对标准偏差15。3 10方法线性范围方法线性范围：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5一甲
12、氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6一甲氧嘧啶、磺胺甲基异嚼唑、磺胺多辛、磺胺异嚼唑、磺胺二甲氧哒嗪为oOlmgI。10 mgL，磺胺喹嘿啉为002 mgL20 mgI。4液相色谱一柱后衍生荧光检测法41原理样品中残留的磺胺类药物用乙酸乙酯提取，稀盐酸反提取，正己烷脱脂，反相色谱柱分离，荧光胺柱后衍生，荧光检测器检测，内标法定量。3农业部958号公告一12-200742试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GBT 6682一级水的标准。421标准品：磺胺、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5一甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6一甲氧嘧啶、磺胺甲基异
13、嘿唑、磺胺多辛、磺胺异嚼唑、磺胺二甲氧哒嚷、磺胺喹嗯啉，纯度均大于980。4 22荧光胺(fluorescamine)：纯度大于99o。423乙酸乙酯。424盐酸。425正己烷。426甲醇：色谱纯。427乙腈：色谱纯。4 2 8冰乙酸：优级纯。4 2 9乙酸钠：优级纯。4210 2molL盐酸溶液；量取180mL盐酸，加水定容至1 000mL。4211 2(vv)乙酸溶液：量取20mL冰乙酸，加水定容至1 000mL。4212 35 molL乙酸钠溶液：称取287 g无水乙酸钠溶于蒸馏水中，定容至100 mL。4213 02ragmL荧光胺溶液：称取004 g荧光胺，加100mL乙腈、20mL
14、甲醇、80mL乙酸溶液，摇匀，存放在暗处。现配现用。4214标准储备液：称取各种磺胺标准品各10 mg(称准至001 mg)，用甲醇分别溶解并定容至10 mL，各磺胺标准储备液浓度为1 000 mgL。避光冷藏保存，保存期为1个月。4215内标储备液：称取磺胺吡啶标准品10 rag(称准至001 mg)，用甲醇溶解并定容至10 mL，该内标储备液浓度为1 000 ragL。避光冷藏保存，保存期为1个月。4 216混合标准中间液：适量移取标准储备液(4214)，用甲醇稀释并定容至10 mL，在室温下混匀。其中磺胺20 mgL、磺胺嘧啶40 ragL、磺胺噻唑40 ragL、磺胺甲基嘧啶40 ra
15、gL、磺胺5一甲氧嘧啶80ragL、磺胺二甲基嘧啶40ragI。、磺胺甲氧哒嗪80ragL、磺胺氯哒嗪80mgI、磺胺6一甲氧嘧啶80ragL、磺胺甲基异曝唑80 ragL、磺胺多辛80 ragL、磺胺异嚼唑80 ragI。、磺胺二甲氧哒嗪80 ragL、磺胺喹嗯啉160 ragL。避光冷藏保存，保存期为1周。4 217内标中间液：取内标储备液1 mL，用甲醇稀释并定容至25 mL，在室温下混匀，该内标中间液浓度为40 ragL。避光冷藏保存，保存期为1周。4，218混合标准使用液：取混合标准中间液5 mL，用乙酸乙酯稀释并定容至100 mL。现配现用。4219内标使用液：取内标中间液5 mL
16、，用乙酸乙酯稀释并定容至100 mL。现配现用。43仪器与设备431液相色谱仪：配荧光检测器，柱后衍生装置。4。3 2电子天平：感量0000i g。43 3电子天平：感量001 g。434高速组织捣碎机。435均质机：14 000 rrain。436离心机：5 000 rrain。43 7氮吹仪。438旋涡混匀器。4农业部958号公告一12-200744色谱条件441色谱柱：ODSC185”m，46 mm250 1Tlln，或性能相当者。442柱温：40。443柱后反应器温度：70C。444衍生试剂流速：01 mI。min。445流动相：乙腈、甲醇和2乙酸溶液(4211)，梯度洗脱参数见表1。
17、446流速：06mLmin。447进样量：50L。4 4 8激发波长：405 nm。4 4 9发射波长：495 nnl。45分析步骤451样品制备按351条的规定执行。4 52提取将样品解冻，称取1000 g，置于50 mL离心管中。加人磺胺吡啶内标使用液250“I。，然后加入乙酸乙酯30mL，均质机14 000 rmin均质1min，振动2min，3 000 rmin离心10min，将乙酸乙酯层小心转移到100 mL梨形瓶中。再向原离心管中加入乙酸乙酯20 mL，旋涡混匀30 s，振动2 min，3 000 rrain离心10min，将乙酸乙酯层小心转移到原100mL梨形瓶中，40减压浓缩至
18、约1mL。然后将梨形瓶中的溶液转移至15 mL刻度离心管，再用4 mL乙酸乙酯分两次清洗梨形瓶，溶液合并至15mL亥lJ度离心管。在离心管中加入200mI，2molL盐酸溶液(4210)，旋涡混匀1rain，加盖后振动2 rain，3 000 rmin离心8 min，移去乙酸乙酯层，在余液中加入正己烷5 mL，旋涡混匀30 S，3 000 rmin离，68min，移去正己烷层，045 pm微孔滤膜过滤。取200止滤液、200 pL乙酸钠溶液、50 pI，乙腈和50“L甲醇加入到试样瓶中，旋涡混匀1 rain，供液相色谱分析。4 5 3色谱分析取50“L进样，记录峰高，响应值均应在仪器检测的线性
19、范围之内。根据标准样品的保留时间定性，内标法定量。14种磺胺参考保留时间参见附录B。4 54工作曲线称取空白样品1000 g，分别添加混合标准使用液(4218)25 p【。、100 pL、250 pL、500 pL、1 000pL，同时分别添加内标使用液(4219)250 pL，按452、453操作，以磺胺峰高为纵坐标，磺胺浓度为横坐标，绘制工作曲线。4 6计算按36条的规定执行。47方法检出限本方法检出限：磺胺为25“gkg；磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶为5“gb；磺胺5甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6一甲氧嘧啶、磺胺甲基异嘿唑、磺胺多辛、磺胺异曙唑、磺胺二甲氧
20、哒嗪为10 pgkg；磺胺喹嘿啉为20“gkg。48回收率本方法回收率70。49精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对标准偏差】5。4 10方法线性范围5农业部958号公告一122007方法线性范围：磺胺为o002 5 ragLo5ragL，磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶为0005 ragL1_OmgL，磺胺5一甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6一甲氧嘧啶、磺胺甲基异嘿唑、磺胺多辛、磺胺异嗯唑、磺胺二甲氧哒嗪为001 mgL20 mgL，磺胺喹暖啉为002 mgL40 mgL。农业部958号公告一122007附录A(资料性附录)液相色谱一紫外检测法13种磺胺
21、类药物色谱分析图及保留时间10 20 30 40图A1 液相色谱一紫外检测法检测1 3种磺胺标准物质色谱图表A 1 13种磺胺参考保留时间保留时间 保留时间药物名称 药物名称磺胺嘧啶 11778 磺胺6甲氧嘧啶 30436磺胺噻唑 12676 磺胺甲基异曙唑 32098磺胺甲基嘧啶 17265 磺胺多辛 33541磺胺5一甲氧嘧啶 23354 磺胺异嘿唑 34889磺胺二甲基嘧啶 24798 磺胺二甲氧哒嗪 44154磺胺甲氧哒嗪 25453 磺胺喹嚼啉 45858磺胺氯哒嗪 29777农业部958号公告一122007附录B(资料性附录)液相色谱柱后衍生荧光检测法14种磺胺类药物色谱分析图及保留时间10 20 30 40 50 Minutes图B1 液相色谱柱后衍生荧光检测法检测14种磺胺标准物质色谱图表B 1 14种磺胺参考保留时间保留时间 保留时间药物名称 药物名称磺胺 7344 磺胺氯哒嗪 31099磺胺嘧啶 12，830 磺胺6一甲氧嘧啶 31756磺胺噻唑 13817 磺胺甲基异嚼唑 33，470磺胺甲基嘧啶 18214 磺胺多辛 34672磺胺5一甲氧嘧啶 24386 磺胺异嘿唑 36296磺胺二甲基嘧啶 25382 磺胺二甲氧哒嗪 46048磺胺甲氧哒嗪 26480 磺胺喹曝啉 480118
