1、ICS 67050B 50中华人民 ，-H、-禾I口，、n 国国家标准农业部958号公告一142007水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定气相色谱一质谱法Determination of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in fisheryproducts by GC-MS20071218发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 昌农业部958号公告一142007本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部渔业局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会归口。本标准起草单位：国家水产
2、品质量监督检验中心。本标准主要起草人：冷凯良、孙伟红、王志杰、王联珠、翟毓秀。农业部958号公告一142007水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定气相色谱一质谱法1范围本标准规定了水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的气相色谱一质谱测定方法。本标准适用于水产品可食部分中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
3、GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中残留的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素以乙酸乙酯超声波提取，正己烷液一液萃取去脂，固相萃取柱净化，硅烷化衍生后用气相色谱一质谱仪测定，内标法定量。4试剂除另有说明外，试验用水为GBT 6682规定的一级水。4 1乙酸乙酯：色谱纯。4 2正己烷：优级纯。4 3甲醇：色谱纯。4 4乙腈：色谱纯。45无水硫酸钠：分析纯，650。C灼烧4 h，冷却后贮于密闭容器中备用。46氯化钠：分析纯。47 4氯化钠溶液：称取氯化钠20 g，加水溶解，稀释到500 mL。48衍生化试剂；N，O一双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)三甲基氯硅烷(TMCS)体积
4、比99：l。49氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准品：纯度均99。4 10氘代氯霉素内标标准溶液：100 ugmL。4”氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准储备溶液：分别准确称取氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准品001 g(准确到0000 1 g)，用甲醇溶解并定容于50mL容量瓶中，分别配成浓度为200 ugmL的标准储备溶液，置-18冰箱中保存，可使用12个月。412氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混和标准储备溶液：分别准确移取适量氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准储备溶液，用甲醇稀释配成浓度为1 ugmL的混合标准储备溶液，置一18。C冰箱中保存，可使用6个月。413氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混和
5、标准使用溶液：准确移取适量氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准储备溶液，用甲醇稀释配成浓度为01 ugmL的混合标准使用溶液，置4冰箱中保存，可使农业部958号公告一142007用3个月。414氘代氯霉素内标标准储备溶液：准确移取适量氘代氯霉素标准溶液(410)，用甲醇稀释配成浓度为1 ttgmL的内标标准储备溶液，置一18冰箱中保存，可使用6个月。4 15氘代氯霉素内标标准使用溶液：准确移取适量氘代氯霉素内标标准储备溶液，用甲醇稀释配成浓度为01 pgmL的内标标准使用溶液，置4。C冰箱中保存，可使用3个月。5仪器与设备51气相色谱一质谱仪：配有化学源。52电子天平：感量0000 1 g和0
6、01 g各一台。5 3离心机。54涡旋混合器。55超声波清洗器。56旋转蒸发器。57烘箱。58梨形瓶：50 mL、100 mL，细口。59离心管：50 mL，具塞。510刻度离心管：5 mL，具塞。511氮吹仪。512 C。8固相萃取柱，填料300 mg。5 13固相萃取装置。514无水硫酸钠柱：砂芯玻璃层析柱中装无水硫酸钠5 g。515高速组织捣碎机：转速不低于20 000 rrain。6测定步骤61试样的制备鱼，去鳞，沿脊背取肌肉和皮；虾，去头、去壳、去附肢，取可食肌肉部分；贝类，去壳，取可食部分；蟹、甲鱼等，取可食肌肉部分。样品切为不大于05 cmX05 cmX05 cm的小块后混匀，高
7、速组织捣碎机(515)充分匀浆，密封，标明标记。一18。C以下冷冻保存。62提取将试样解冻，称取试样5 g(精确到001 g)，置于50 mL具塞离心管中，加入氘代氯霉素内标标准使用溶液(415)200“L，再加入乙酸乙酯20 mI。，涡旋混合1 rain，超声20 rain提取氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素，4 000 rmin离心5mln，将乙酸乙酯层转移到100mL梨形瓶中。离心管中再加入乙酸乙酯15mL，涡旋混合均匀，超声波提取5min，4 000 rrain离心5rain，合并乙酸乙酯提取液于100mL梨形瓶中。在梨形瓶中加人5 mL4NaCL溶液，于50。C55C水浴中旋转蒸发至溶液
8、体积小于5 mL，蒸除乙酸乙酯。6 3脱脂向梨形瓶中加入15mL正己烷和20mL4氯化钠溶液，盖塞振荡混合lmin，充分混合提取脂肪，转移到另一50 mL离心管中，4 000 rmin离心2 rain，除去上层正己烷相。再加入10mL正己烷，重复提取一遍，弃去正己烷相。水相中加入15 mL乙酸乙酯，旋涡混合2 min，4 000 rrain离心3 rain，吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱(514)脱水过滤于50mL梨形瓶中；再向水相中加入5 mL乙酸乙酯，重复上述操作；用5 mL农业部958号公告一142007乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱，合并提取液于50 mL梨形瓶中，在45。C水浴中旋转蒸发
9、至近干。加入2mL乙酸乙酯溶解提取物并转移于5 mL具塞刻度离心管(510)中，用1 mL乙酸乙酯洗涤梨形瓶，合并乙酸乙酯于刻度离心管中；于5055的砂浴中吹氮蒸发至近干，再用1 mL乙酸乙酯洗涤刻度离心管壁并吹干，待衍生化。64 C，8柱净化通常情况下，经63步骤净化的样品，离心管内应无明显残留物。但是，部分油脂含量高、不易净化的样品，离心管内可能存有明显残留物，可经C，。柱进一步净化。给每个试样准备一根C，。柱，依次用5 mL甲醇和10 mL水淋洗活化Cts柱，弃掉洗涤液。用5mL5(vV)的乙腈水溶液溶解63中的提取物，移人C1s柱过柱，流速保持每秒一滴，用2 mL水分两次洗涤梨形瓶并过
10、柱；5mL水淋洗C。s柱，弃去全部淋洗液；微氮吹干或负压抽干Cs柱；用3mL乙腈分2次洗脱C，。柱，合并洗脱液于5mL具塞刻度离心管中。于5055的砂浴中吹氮蒸发至近干，再用1 mL乙腈洗涤离心管壁并吹干，待衍生化。65衍生化在吹千的提取物中加入100“L衍生化试剂(48)，盖塞并涡旋混合10 s，在70*(2烘箱中反应30min；取出冷却至室温，氮气吹干，准确加入05 ml。正己烷，涡旋混匀，供气相色谱一质谱分析。6 6基质混合标准工作溶液根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围，移取一定量的混合标准使用溶液(4。13)加人5 g空白试样中，以下按本方法62、63、64和65步骤操作。6 7测定6
11、 7 1 气相色谱一质谱测定条件色谱柱：DB一5 ms石英毛细管柱，30 mX025 mmX025 gm，或性能相当者。载气：氦气，纯度99999，流速10 mLmin。进样口温度：220。柱温；初始柱温50，保持1 rain，25min升至280，保持5 min。进样方式：无分流进样。进样量：1”L。接口温度：250。离子源：负化学源。离子源温度：120。反应气：甲烷，纯度9999。反应气流量：35。溶剂延迟：10 min。测定方式：选择离子检测(SIM)。监测离子：氘代氯霉素硅烷化衍生物mz381、383、471、473；氯霉素硅烷化衍生物mz376、378、466、468；甲砜霉素硅烷化
12、衍生物mz409、411、499、501；氟甲砜霉素硅烷化衍生物mz339、341、429、431。672定性测定分别注入1止适当浓度的氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素混合标准衍生化工作液及试样衍生化溶液于气相色谱质谱仪中，在同一条件下进行分析，如试样检出色谱峰的保留时间与标准品相一致，并且在扣除背景后的试样质谱图中，所选择的特征离子均出现，而且所选择离子的相对丰度与浓度相近的标准品衍生物相应选择离子的相对丰度相一致，且偏差不超过表1规定的范围，则可判断试样中存在被测化合物。3农业部958号公告一142007表1 试样相对离子丰度与标准物质相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 最大允许偏差()
13、()50 土202050 土251020 土3010 士5067 3定量测定分别以mz 471、466、409、429为氘代氯霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的定量离子，以峰面积按内标法进行单点或多点校准定量，标准工作液和试样液中药物响应值均应在仪器检测线性范围内。为减少基质的影响，定量用标准应采用空白基质加标混合标准工作溶液。68空白实验除不加试样外，均按上述测定步骤进行。7计算试样中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留量按公式(1)分别计算。x一丕g圣垒丕垒!丕!丕!QQQf1、一(名A，A。m 式中：x试样中待测组分残留量，单位为微克每千克(bigkg)；c基质标准工作溶液中被测物的浓度
14、，单位为微克每毫升(“gmL)；G基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为微克每毫升(ugmL)；G试样溶液中内标物的浓度，单位为微克每毫升(t-gmL)；A试样溶液中被测组分的峰面积；A：基质标准工作溶液中被测物的峰面积；A。基质标准工作溶液中内标物的峰面积；A试样溶液中内标物的峰面积；V试样溶液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m试样称样量，单位为克(g)。注：计算结果应扣除空白值，结果保留两位小数。8精密度本方法的批内变异系数CV15，批间变异系数CV20。9灵敏度方法检出限：氯霉素为03 ttgkg，甲砜霉素和氟甲砜霉素均为10 ttgkg。10线性范围氯霉素0002 btgmI。O2#
15、gmL，甲砜霉素和氟甲砜霉素0005 ttgmL02#gmL。11准确度氯霉素在添加浓度为03 pgkg100 pgkg，甲砜霉素和氟quit霉素在添加浓度为10 pgkg100pgkg时，回收率均为70肛120。4附录A(资料性附录)标准物质衍生物选择离子流围和质谱图农业部958号公告一142007A1氘代氯霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素标准品衍生物选择离子流图，见图A1。兰j 118。：5一c8p” 6 00700 800 9 00 1000 11 00 1200 13 00 14 00 1500l一一一一一一一一一，七一一一 6 00 7 00 8 00 9 00 】000 11 0
16、0 1200 13 00 1400 15006 00 7 00 800 9 00 1000 11 00 1200 13 00 14 00 15 001 1”。j 旷L，。，。，。U，一rn。A 2氘代氯霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素空白加标样品衍生物选择离子流图，见图A2。习 1卜wi 儿_P_十r1_f_tP1f_f_；1r日1十rT1r1111rT1rrllrP_1r一” 10 50 11 00 11 50 12 00 12 50 13 00 13 50 1400 14 5000j 1卜_11111111_111_111_1111_11111_11_11111rrrrrrrT1TT11
17、11111111111111111rr一” 1050 11 00 11 50 12 00 12 50 13 00 13 50 1400 14 5000j 17f4n一1，。，。，Jj，。，。，一o赢F百丽矗F1丽磊1丽磊，1面话F一图A 2队0oo农业部958号公告一142007A3氘代氯霉素标准品衍生物选择离子质谱图，见图A3。图A 3A4氯霉素标准品衍生物选择离子质谱图，见图A4。d 6604680376。J378。图A，4A 5 甲砜霉素标准品衍生物选择离子质谱图，见图A5。农业部958号公告一142007400 405 410 415 420 425 430 435 440 445 450 455 460 465 470 475 480 485 490 495 500 505 510图A 5A6氟甲砜霉素标准品衍生物选择离子质谱图，见图A6。FF图A 6
