1、ICS 67120B 45中华人民共和国国家标准农业部958号公告一72007猪鸡可食性组织中青霉素类药物残留检测方法高效液相色谱法High performance liquid chromatographic method for determination ofpeuicillins residues in edible tissues of pig and chicken20071229发布 20080301实施中华人民共和国农业部发布刖 置农业部958号公告一72007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准由华中农业大学负责起草。本标准主要起草人：袁
2、宗辉、陶燕飞、王玉莲、陈冬梅、黄玲利、肖爱国、彭大鹏、刘振利、戴梦红。本标准系首次发雍的农业标准。农业部958号公告一72007猪鸡可食性组织中青霉素类药物残留检测方法高效液相色谱法1范围本标准规定了猪鸡可食性组织中青霉素类抗生素残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪的肌肉、肝脏、肾脏组织、鸡的肌肉、肝脏组织中阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨苄西林、双氯西林残留量同时检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文
3、件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 11 2000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则(ISOIEC Directives，Part 3，1997，Rules for the structure and drafting of International Standards，NEQ)GBT 6682-1992分析实验室用水规则和试验方法农业部农牧发E20033 1号兽药残留试验技术规范(试行)3制样3 1样品的制备取新鲜或冷冻空白、供试组织，去除筋膜，5 000rmin 5 rain绞碎，并使均质。32样品的保存一20以下贮存。4测定方法4 1方法提要
4、或原理肌肉样品用磷酸缓冲液提取，肝脏、肾脏样品先用乙腈再用磷酸缓冲液提取。肌肉、肝脏、肾脏提取液过SPE柱净化，用1，2，4一三唑汞()溶液衍生，供高效液相色谱(紫外检测器)测定，外标法定量。4 2试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水符合GBT 6682规定的二级水。4 2 1青霉素v钾：含量不少于98。4 2 2青霉素G钠：含量不少于98。423双氯西林钠：含量不少于98。4 24氨苄西林：含量不少于97。425阿莫西林：含量不少于98。426甲醇：色谱纯。4 2 7乙腈：色谱纯。428二水磷酸二氢钠(NaH。P042He0)。4 2 9正己烷。1农业部958号公告720
5、074 210无水磷酸氢二钠。42 11氢氧化钠。4 2 12硫酸氢化四丁基铵。4213五水硫代硫酸钠(Na。S20。5HzO)。4214 1，2，4三唑。4 215氯化钠。4216氯化汞()。4 2 17流动相。A相：称取无水磷酸氢二钠4969 g、二水磷酸氢二钠10139 g、五水硫代硫酸钠3894 g、硫酸氢化四丁基铵6791 g，用适量的水溶解，稀释到1 000 mL。B相：乙腈。4 218磷酸缓冲液称取无水磷酸氢二钠14196 g，用适量的水溶解，稀释到1 000 mL，4。C保存。4219氯化钠溶液称取氯化钠200 g，溶解于适量水中，稀释到1 000 mL，室温保存。4220标准
6、稀释液量取流动相A50 mL，用2 molL氢氧化钠调节pH至80，然后与乙腈等体积混合，现配现用。4221苯甲酸酐溶液称取苯甲酸酐2262 g，用适量乙腈溶解，稀释到50 mL，4。C保存。4 222氯化汞()溶液称取氯化汞(1I)o271 5 g，用适量水溶解，稀释到10 mL，现配现用。4 2 23衍生化试剂称取1，2，4一三唑1378 g，用水60mL溶解，加入氯化汞溶液10mL，用5moLLNaOH溶液调节pH至90，用水稀释到100 mL，4。C避光保存。4224标准贮备液的配制准确称量相应质量阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨苄西林、双氯西林的标准品100 rag(折算后)，用水溶
7、解并定容至10 mL，得到1 nagmI的标准贮备液。一20避光保存，有效期1个月。4 3仪器和设备4 31高效液相色谱仪(配紫外检测器)。432分析天平：感量0000 01 g。433分析天平：感量0001 g。434离心机(5 000 rmin)。435冷冻高速离心机(10 000 rrain)。436恒温水浴锅。437旋涡混合器。4 3 8固相萃取装置。4 3 9超声波清洗机。4310组织匀浆机。4 3 11氮气吹干装置。4 3 12固相萃取柱C18：500 mg3mL。2农业部958号公告一7200744测定步骤4 41试料的制备试料的制备包括：取均质后的供试样品，作为供试试料。取均质
8、后的空白样品，作为空白试料。4 42提取称取试料5 g+005 g，置于50mL玻璃离心管中，加磷酸缓冲液15mL，振荡5min混匀，加正己烷5 mL，振荡混匀，3 000 rrain离心15 min，弃掉正己烷层(上层)，转移水层(中间层)至另一洁净玻璃离心管中，然后用磷酸缓冲液各10 mL和正己烷各5 ml，重复提取2次，除去正己烷层，合并3次的提取液(水层)供SPE净化。称取肾脏或肝脏样品5 g+O05 g，置于50 mI离心管中，加入乙腈20 mI，混匀，再加入正己烷5mL，混匀，静置5min，3 000 rrain离心15min，除去正己烷层，转移乙腈层至另一离心管中。残渣中加入磷酸
9、缓冲液lOmL和正己烷5mL，混匀，静置，3 000 rrain离心15min，除去正己烷层，水层与乙腈层合并，供SPE净化。4 4 3净化固相萃取柱依次用甲醇、水、氯化钠溶液和磷酸缓冲液各3 mL活化，将提取液过C。柱，用水1 mL淋洗、乙腈3mI洗脱，用10mI，的玻璃离心管收集洗脱液，45。C50。C水浴氮气吹于。4 44衍生化反应洗脱液在45。C50。CT氮气吹干，加标准稀释液05 mI。旋涡振荡溶解，转入15 mL聚丙烯离心管中，加无水苯甲酸酐溶液25 ffL，旋涡混匀，50。C水浴反应5 min，冰浴、快速冷却，加衍生化试剂250,uI一，旋涡混匀，65水浴反应10rain，快速冰
10、浴冷却，在4。CTl0 000 rmin离心10min，取上清液供高效液相色谱分析。4 4 5标准曲线的制备倍比稀释得到阿奠西林、青霉素G、青霉索V、氨苄西林、双氯西林浓度分别为25 pgI。50”gl。、100gL、250gL、500t,gI，、1 000,gI，、l 500 pgI。混合标准溶液。取混合标准液05 mL，按照444步骤进行衍生，高效液相色谱分析，每个浓度重复3次，将每测得的峰面积与对应浓度拟合，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。4 4 6测定4 46 1色谱条件色谱柱：waters symmetryC,柱，39 mm(id)150 Film，粒径5 Mm，或相当者。流动相
11、：A相B相一6535(vv)。流速：l mIrain。紫外检测波长：325 nnl。进样量：100 uI。4 4 6 2色谱测定取试验溶液和相应的标准溶液，做单点或多点校准，按外标法，以峰面积定量，即得。4 5空白试验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。46结果计算和表述4 6 1单点校准试料中青霉素类药物的残留量(figkg)，按式(1)计算：农业部958号公告一72007。 A凸VA5W式中：x试料中青霉素类抗生素残留量，,gkg；A试样溶液中青霉素类药物衍生物的峰面积；As标准工作液中青霉素类药物衍生物的峰面积；cs一一标准工作液中青霉素类药物的浓度，“gI，；v溶解残余物
12、所得溶液体积，ml；W组织样品质量，g。5检验方法灵敏度、准确度、精密度5 1灵敏度本方法在猪的肌肉、肝脏、肾脏组织和鸡的肌肉、肝脏组织中的检测限为5,gkg，定量限为10 tgkg。5 2准确度本方法在10且gkg100 tgkg添加浓度的回收率为701lo。53精密度本方法在批内、批问变异系数CV20。4附录A(资料性附录)高效液相色谱图农业部958号公告一72007图A 1 青霉素类药物阿莫西林、青霉素v、青霉素G、氨苄西林、双氯西林】mAU2520151050标准溶液浓度为25斗gL衍生物色谱图图A 2猪肌肉添加青霉素类药物I 10 Ilgkg)衍生物色谱图一91百Id口ji=、一净=一111。Iu岛iiii、一oi一1II。I目00iij八一i0一川川川U一圳，。，：，。鲁。_【_q八L1_；暑鼍；儿一；鼋；l儿可。uII鼋曙kIIIlllllll、v 卜； 口一I|一ig。jiii农业部958号公告一72007世坦L图A 3鸡肌肉添加青霉素类药物(10嶂kg)衍生物色谱图
