1、GB 16884-1997 前去一口流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是由脑膜炎奈瑟氏菌(N白ssenamemng巾dis，Nm)通过呼吸道传播所引起的化服性脑膜炎，常在冬春季节引起发病与流行，患者以儿童为多见，流行时成年人发病亦增多。人受Nm感染后大多数表现为鼻咽部带菌状态，只有少数成为流脑患者，其主要临床表现为突发性高热、头痛、呕吐、皮肤和粘膜出血点或痕斑及颈项强直等脑膜剌激征，脑脊液呈化旅性改变。此外.Nm也可不侵犯脑脊髓膜.仅表现为败血症，病重者可呈暴发型发作。为了贯彻执行中华人民共和囡传染病防治法).认真做好流脑流行病学监测与控制的工作，预防此病发病大幅度回升，控制其流行，特制定本标准。本
2、标准的附录A和B为标准的附录g附录C、D、E和F皆为提示的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准负责起草单位z中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所s参加起草单位z北京佑安医院和北京市卫生防疫站。本标准主要起草人g胡绪敬、徐莲芝、吴贵坤。本标准委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。,()f 中华人民共和国国家标准流行性脑脊髓膜炎诊断标准和处理原则GB 16884-1997 1 范围Diagnostic criteria and principles of manegement for epidemic cerebrospinal meningitis 本标准规定r流
3、脑的诊断标准和处理原则。本标准适用F各级、各类医疗保健、卫生防疫机构和人员对流脑病例诊断、报告与处理。2 诊断原则2. 1 应根据流行病学资料和临床表现及实验室检验结果做出临床诊断。2.2 确诊需要培养Nm或检测Nm群特异多糖抗原或Nm的DNA特异片段或检测l病人急性期和恢复期血清中抗Nm特异抗体。3 诊断标准3. 1 流行病学史在冬春季节和流行地区内，儿童患病者最为多见。有已患者在发病前7天有明显密切接触史。3. 2 临床表现3. 2. 1 突然寒战、高热、恶心、呕吐、流涕、鼻塞、咽痛、全身疼痛、头痛加重。3.2.2 面色苍白、四肢发凉、皮肤发花并有散在的小出血点、唇周及指端青紫、唇周单纯痕
4、磅。3. 2. 3 烦躁不安、谁妄、昏迷或惊厥。3. 2. 4 皮肤、粘膜痕点典型或融合成旅斑，血压明显下降、脉搏细速、脉压差缩小。3. 2. 5 颈项强直、角弓反张、克氏征和布氏征阳性。3.2.6 随孔大小不等、边缘不整、对光反应迟钝、眼球常凝视。3.2.7 呼吸快慢及深浅不均或呼吸暂停。3. 2. 8 幼儿发病多不典型，常见高热、呕吐、嗜睡外.还多见极度不安与惊厥、拒.1L、尖叫、腹泻、咳嗽、双目凝视、颈项强直和布氏征阳性，真他脑膜刺激征可能缺项。前囱未闭者多见隆起.日K吐频繁而失水抒也可出现囱门下陷。3. 3 实验室诊断3. 3. 1 血象:白细胞数显著增高，最高可达40X 10 /L.
5、中性粒细胞在80%90%以上。3. 3. 2 疑为流脑者应做腰椎穿刺检在.脑脊液化SF)压力常增高达1.96 kPa以上，典型病例CSF的外观混浊虹1米汤样甚或月在样:白细胞数增多.可达每升数亿，以多形核细胞为主，蛋白质显著增高，叮达15g/L;糖:!i:常低于2.22mmol/L , 在化物也稍降低。CSF涂片可在中性粒细胞内找到草、三氏JJ性双球郎。3. 3. 3 从病人(丁SF或急性期血液分离到rJNm.见附录A(标准的附没)。国家技术监督局1997-06-16批准1998-01-01实施:;O GB 16884一19973. 3. 4 从病人急性期血清或尿或CSF中检测到Nm群特异性多
6、糖抗原，见附录C(标准的附录)。3. 3. 5 检测病人恢复期血清抗体效价较急性期里4倍或4倍以上升高，见附录B(标准的附录)。3. 3. 6 以PCR检测到病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，见附录D(提示的附录)。3. 4 病例分类3. 4. 1 疑似病例，3.1加3.2. 1或3.2. 2或3.2. 3之一项。3. 4. 2 临床确诊病例z疑似病例加3.2. 4或3.2. 5或3.2. 6或3.2. 7之一项。3.4.3 确诊病例疑似病例或临床确诊病例加3.3. 3或3.3.4或3.3. 5或3.3. 6之一项。4 处理原则4. , 对病人早期处理，见附录E(提示的附录)。4.
7、 ,. 1 发现疫情及时向卫生防疫部门报告。4. 1. 2 就地隔离，抢救治疗，降低病死率。4. ,. 3 给予抗菌药物，及时控制感染。4. 1.4 早期发现并及时纠正休克与弥漫性血管内凝血(DIC)。4. ,. 5 若早期发现颅内压增高症状，及时应用脱水疗法防治脑痛和呼吸衰竭。4.2 对易感人群的处理，见附录F(提示的附录。4. 2. 1 与患者密切接触的人群出现上呼吸道感染样病人，应按轻症流脑患者处理。4.2.2 根据流行病学监测结果，制定A群脑膜炎双球菌多糖茵茵预防注射的计划，在流行前期完成接种任务.免疫对象接种率应达到90%以上。4.2.3 除了完成上述茵茵常规免疫任务以外，还应备有应
8、急接种用的A群脑膜炎双球菌多糖商苗，用于控制流脑暴发流行。4.2.4 在未免疫地区出现A群Nm引起流脑暴发流行时，除了对15岁以下儿童，还应酌情对与病人密切接触的成人应急接种上述菌苗。4.2.5 目前在我国，若出现非A群Nm引起流脑局部暴发，应及时对病人全家以及与其毗连的邻居实施抗菌药物预防。,) ( )抖GB 168841997 附录A(标准的附录)流脑病原学诊断方法A1 病原体(脑膜炎奈瑟氏菌Neisseriameningitidis)分离从疑似流脑患者采集CSF或急性期血液分离NmoA1. 1 标本的采集A 1. 1. 1 CSF，无菌操作，吸出CSF2 mL，立即放到j无菌试管内离心(
9、20003 000 r/min , 30 min)，用灭菌过的毛细管吸取沉淀物直接接种到10%羊血巧克力色琼脂上(CSF上清液部分供检测Nm特异抗原.亦可将其眨于20C待测5%工氧化碳环境37C培养2472h，每日检查细菌生长的情况，及时分离纯培养物供鉴定。A1.1.2 血液:采取病人急性期静脉血液6mL，无菌操作往盛有30mL增菌用的葡萄糖肉汤三角瓶内注入4mL血液余下的2时，血液向上离心后吸出血清，供检测N响特异抗原和抗体，亦叮将其转子20 C待回1), I巧上述条件培养2472h，每日进行分离培养。A 1.2 接种和菌种鉴定A 1. 2. 1 细商形态:Nm应为革兰氏阴性，呈卵圆形或肾形
10、，0.8mXO.6m大小。常成对排列，临近两边扁平凹陷。A 1. 2. 2 菌落，Nm接种于巧克力色琼脂平皿上，5%二氧化碳，37C培养24h后，其菌落直径约1mm , 表面突起、光滑、湿润、圆整、略带灰白色、半透明、不溶血、无色素。培养时间延长，菌落增大、变成黄色、不透明，并可出现颗粒状中心和放射性周边。A 1. 2. 3 生长及抗原特性.绝大多数Nm菌株分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气。不分解照糖、果糖和乳糖。过氧化酶和氧化酶阳性。Nm新分离菌株具有下列主要抗原z血清群特异性英膜多糖，主要外膜蛋白-OMP(包括血清型特异的2/3类OMP，亚型特异的1类OMP以及4与5类OMP)，铁调节蛋白，
11、脂寡糖(LOS)，H.8脂蛋白，还有菌毛抗原等，根据群特异性英膜多糖的结构与组成成分，Nm可分为13个血清群(A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135.X、Y、Z)，其中90%以上的病例是由A、日和C群Nm引起的。根据2/3类OMPf将B群与C群Nm分成20个血清型，但差不多半数菌株目前尚不能分型。在可分型菌株中，以15、2和4型，Pl.2、Pl.1、Pl.12、Pl.15及Pl.16亚型多见F对于A群Nm现有4与21两个血清型，以Pl.7号P l. 9亚型多见。Nm还可以分成13个LOS免疫型，其中A群以LI0和Lll型多见，8群中以L3.7, 9 复合型多见。Nm群特异性英膜多糖、
12、型和亚型的OMP及LOS等抗原成分对流脑发病与流行及真商苗的研究均具有重要价值。B1 玻片凝集试验B1.1 H的附录B(标准的附录)流脑血清学诊断方法应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。81.2 材料;)09 G8 168841997 B1. 2. 1 待检的Nm菌株纯培养物。81.2.2 Nm诊断血清.多价1(包含A、B、C、D群).多价ll包含1889(Y)、1890(H) , 1892 (29E汀.:t价m包含319(WI35)、1916(川、1486(1)、181l(K)群及各群单价血惰，共计14种。81.2.3 洁净载玻片。81.2.4 牛理盐水。81.3 试验
13、方法8 1. 3. 1 先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。81. 3. 2 用白金耳刮取菌苔少许，在玻片上沾取少量血清，在旁研磨均匀，再与血清混匀。81. 3. 3 轻轻摇动玻片数次，在l，._，2 min内出现明显凝集荐，即为阳性。81. 3. 4 检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价E或多价E血清。若发生凝集，再用单价血清定群。从病人分离的疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则送研究单位进一步鉴定。81. 3. 5 在玻片k与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。82 酶联免疫吸附试
14、验(ELISA)82.1 目的应用ELlSA间接法测病人急性期和恢复期血清中的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。82.2 材料82. 2. 1 酶联免疫吸附试验检测仪。82. 2. 2 聚苯乙烯板(40孔或96孔)。82. 2. 3 加样器(单头或4头或8头，定量为0200L)。82. 2. 4 羊抗人!gG辣根过氧化酶结合物。82. 2. 5 试验质控血清(抗体阳性和阴性的人血清)。82. 2. 6 商体抗原(A、B和C群Nm标准菌株或A群Nm多糖菌苗。82. 2. 7 包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液)碳酸氢纳(NaHCO，)2. 9日碳酸销(Na2CO，)1. 6
15、g 叠氮销(NaN，)0.2 g 加蒸馆水至1000mL.pH9. 6. lt. 4 C可备用两周。82. 2. 8 洗涤液(0.5mol/L氯化纳): 氯化饷(NaCIl29.3日nt温20(Tween-20)0.5 mL 力H蒸馈水至1000 mL.1脑用前配制。82. 2. 9 稀释液:;j 七纳(NaCI)磷酸二氢例(KH，PO，) 磷酸氧二纳(Na，HPO， 2H,O) 剧化钥I(KCIl nt温20(Tween-20) 加蒸馆水至000 mL.pH7. 4.n 4C备用。82.2.10 底物缓冲液.() 0.2 mol/L磷酸氢二纳S J (1 8. ()抖。.2日2.9日().
16、2 g (). 5 mL G8 16884一1997磷酸氮二纳(Na，HPO. 12H,O) 35.8 g 蒸馆水500时，(2) O. 1 mol/L拧橡酸拧橡酸C，H，(OH)(COOH)， H,O 10.5 g 蒸馆水500 mL (1)液和(2)液分别景4C备用。l自用前按下述配方配制底物溶液.pH为5.0 , (1)液(2)扫!l(邻苯二胶蒸饱水30%H,O, 82.2.11 填充液z稀释液2.57 mL 2.43 mL 4 mg 5 mL 15L 100 mL 自明胶或牛血清白蛋白CBovineSerium Albumin.BSA) 0.5 g 82. 2. 12 终止溶液，2mo
17、l/L硫酸(H，SO，)。82.3 试验步骤82. 3. 1 包被抗原的制备将Nm纯培养的菌苔刮到生理盐水中，离心(3000r/min.30 min)洗涤菌体3次，再混悬于生理盐水中，置56C 30 min灭活，用比浊法测定菌悬液中细菌浓度.用包被液将其稀释成10个菌/mL作为包被抗原。对于A群Nm.亦可将A群Nm多糖菌苗稀释到10吨/mL进行包被。82. 3. 2 抗原的包被用蒸馆水把酶标板各孔冲洗干净，空干水，l!.37C烘干;往每孔中加包被抗原100L，1: 4 (过夜g倾出孔内液体，用洗涤液冲洗各孔3次.每次1min.并且均在干净的吸水纸上或纱布上拍打酶标板，空干孔内的液体。自2.3.
18、3填充空干孔中液体，用1mL吸管加填充液，每孔加以0.25mL;置室温30min.同上洗涤，空干孔内液体;酶标板暨塑料袋中，密封贮存于C，可备用一个月。82. 3. 4 检测待检血清82.3.4.1 病人急性期和恢复期血清均从此1 2开始，用稀释液连续倍比稀释到第7孔，第8孔以稀释液代替血清作为阴性对照之-;酶标板置37C培育1h后向上洗涤。82.3.4.2 加酶结合物上述酶结合物用稀释液稀释到预试测定的最适工作浓度.每孔加1001-.置37C反应1h后同k洗涤酶标板。82. 3. 4. 3 每孔加B2.2. 10中配制的底物溶液100L，tfuc反应15min ., 82.3.4.4 终止反
19、应每孔加2mol/L硫酸(H，SO，)501-082.3.4.5 测光密度值在495nm波长下测定每孔的光密度值，并记录。82. 3. 4. 6 每次实验设lt171J对照2阳性和阴性血清质控对照，抗原对照(以稀释液代替待检血清，其余同试验组);缓冲液对照(以包被液和稀释液代替抗原和待检血清，其余同试验组)。82.3.4.7 结果判定;) 1 1 GB 16884-1997 若被检孔的光密度值与平行对照孔的光密度值比值(P!N)二三2.即判断为阳性反应。因杀菌力试验B3.1 日的应用微量杀菌力试验(TTC法)测定病人急性期和恢复期血清中对Nm的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体测定
20、。B3.2 材料B3. 2. 1 靶菌:对补体的自然杀菌作用具有耐受性，但对杀菌抗体反应敏感的Nm(A群29019.B群和C群Nm)。83. 2. 2 稀释液:Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水A液s氯化纳(t、laCl)8. 0 g.氯化饵(KC1)0.2g.磷酸氢二纳(Na，HPO，)1. 15 g.磷酸二氢饵(KH2PO, )0.2 g.蒸馆水800mL , B液:氯化钙(CaC12)0.1g.蒸馆水100mL , C液z氧化续(MgC12 6H20)0.1 g.蒸馆水100mL. 上述三液分别灭菌121C.1 5 min.置4C备用。需用时按A液8份.B液和C液各1份的比例混合，pH为7
21、.1。使用时每100mL稀释液加灭活小兔血清1mL，万古霉素500胞，多粘菌素B2 500单位或硫酸抗敌霉素5000单位。配就的稀释液盛于小瓶中，置4C备用2周。83. 2. 3 滴定板z底部呈U形的96孔有机玻璃微滴板，并备用同样大小的普通玻璃作盖板。将它们平放在80C的烤箱内姆2h后备用.试验完毕，以约80C的热水泡板1h杀死靶菌，再以自来水冲洗干净，并用棉棒拭净不洁净的孔。最后以蒸馆水冲洗一次.3TC烤干后同上于80C干烤。滴定板使用一段时间后或遇到杂菌污染较严重时，可用热水杀死靶菌并冲洗干净g在比较稀的硫酸重错酸御清洁液内浸泡4h.冲洗干净后同上处理备用。的.2. 4 兔补体83. 2
22、. 4. 1 补体可从幼龄兔或成龄兔血清中筛选，预试测定要求它们既不能具有自然杀靶菌的活性，但加有已知阳性参考血清时应产生较高杀菌抗体滴度。不过，幼龄兔被选中的机率较高。83.2.4.2 将所选家兔从颈动脉放血或抽取全部心血，置4C.待血液凝固后尽早分离血情，混合后，分装到2mL安瓶中，每只放1mL血清。立即将安瓶置一20C以下冰箱内冷冻过夜，次日进行冷冻干燥。冻干以后再抽样检查时，不应出现非特异杀菌反应，特异杀菌抗体滴度在1 3 200以上则保存在一20C以下冰箱内，可备用3-6个月。为减少补体批次间的差异，可将所选定的兔血清混合后进行冷冻干燥，再作质量检定，合格者则保存于一20C以下。83
23、. 2. 5 氯化三苯囚氮瞠(TriphenylTetrazolium Chloride. TTC)琼脂培养基(TTC琼脂)83. 2. 5. 1 TTC琼脂配方2牛肉膏。.5%，氯化销0.5%.日本多陈3.0%.可溶性淀粉0.2%.以蒸馆水配制，调pH7.4-7. 6. 琼脂0.5%。83. 2. 5. 2 TTC琼脂制作上述培养基成分熔化后，按每10mL或20mL分装于大试管.121C灭菌15min，冷却后宦4C备用。临用前将培养基加热熔化，每10mL培养基加50%葡萄糖注射液O.lmL.l%TTC水溶液(4C避光保存)O.lmL.混匀放在45C水溶液中待用。83.2.5.3 阳性参考血清
24、用Nm免疫兔制备的诊断血清，未加防腐剂，经预试测定其杀菌抗体滴度较高(1: 3 200以上)。8 3. 2.5.4 滴管与滴头采用临床上输液用的玻璃输液接头作滴管，滴头采用12号输液针，在砂轮上磨去针头的斜阳部分.) 1 2 GB 6884997 使其下口里圆形。用滴管与滴头滴稀释液应是40滴/mL士2滴/mL。它们可用于滴加稀释液、补体、靶菌液、TTC琼脂及待检血清。如有条件，血清最好用25L移液器稀释。B3. 3 杀菌抗体测定步骤B3. 3. , 靶商液的制备B3. 3. 开启A、B或C群Nm菌种，接种到巧克力色琼脂平皿上.37C二氧化碳孵箱或烛缸培养15 20 h.挑取35个菌落涂于另一
25、平皿，同上培养1015ho B3. 3. .2 用Nm诊断血情和生理盐水进行玻片凝集及显微镜检查，以核实菌种。B3. 3. ,. 3 菌种被确证以后，取其菌苔，混匀于2mL灭菌脱脂牛奶管中，制成浓菌液，分装若干支小试管，每管约0.2mL.置-20C以下保存.Nm可存活36个月。B3. 3. ,. 4 需用靶菌时，取出一支上述牛奶菌种管，熔化后立即转种并放在4C冰箱内保存，供每日分离靶菌制作菌悬液，可备用2周。在测定抗体的过程中，每次所用靶菌传种的代数保持一致。B3. 3. ,. 5 从所分离的靶菌平皿上挑取35个典型菌落.涂抹转种1/4巧克力色琼脂平皿.37C烛缸培养46h.由j取菌苔.子盛有
26、3.5mL左右稀释液的试管壁上用臼金耳将其充分研磨.制成轻度混浊的均匀菌悬液，其光密度值相当于0.10B3.3.6 取出k述菌悬液2mL加;eIJO. 5 cm的比色杯内，在波长为540nm的分光光度汁上测其光密度值。B3.3. .7 稀释液用量按式(Bl)计算:x OD X 10 O. 1 ) I RU ( 式中.X稀释液用量.mL;OD一光密度值。按照式也1)计算稀释液用茧，然后往里加入0.1mL靶茵悬液，此时相当于光密度值为O.1的靶菌掖作了101音稀释。吹吸均匀后，由其开始再连续作;10 f吉稀释至10-5稀释度，以菌液的最终浓度为每毫升含4000个商落形成单位为宜。稀释时每个稀释度更
27、换一个移液枪头。B3. 3. 1.8 稀释好的靶菌;悬液在1h内用完。若室温较高，可将菌液管琶冰浴中，以防靶茵迅速死亡。B3. 3. 2 杀菌抗体的测定B3. 3. 2. 1 先在微滴板每孔内加1离相当于25L的稀释液。B3. 3. 2. 2 用移液器从每排第一孔内加25L经56C 30 min灭活的待检血清，吹吸510次后吸出25L至F孔，如此作连续倍比稀释至最后孔。每份血清分别用一支移液枪头。B3. 3. 2. 3 从低温冰箱内取出补体，于37C温水中摇动将其速溶，每孔加一滴。若补体己冷冻干燥，可往安瓶内加相当于补体血清原体积的稀释液，使其融化后即刻使用。B3. 3. 2. 4 每孔加一滴
28、稀蒋成合适浓度的靶茵茵液，微滴板置微型振荡器上中速振荡5rnin，再在37C 培养25min.取出后重复上述振荡。B3. 3. 2. 5 每孔加2滴己熔化冷至45C左右的TTC琼脂后，微滴板置37(:烛缸内培养1520h后观察结果。B3. 3. 2. 6 每次试验需做下列对照z阳性参考血清对照;4孔补体对照稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌活性)，4孔细菌生长对照(稀释液、灭活补体和靶茵茵液各1滴)。每次检测时至少每5块微滴板中应有一组上述三种对照试验。B3. 3. 2. 7 往各孔滴完靶菌菌液之后，应将该菌液两滴分别滴加到一个巧克力色琼脂平皿的一端，沿着划好的两条线倾斜F流.于37C
29、烛缸内同时培养，次日检查每滴靶菌的菌落数及其纯度。B3. 3. 2. 8 判断结果时，先检查上述三种对照试验的结果:补体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落;阳性参考血清应达到原来确定的杀菌滴度。若所试各孔中红色点状菌落数目明显地少F补体对照孔或不出现红色点状菌落时.1M )IJ断为杀菌阳性g如果所试孔中的菌落数目接近补体对照: 1:1 GB 16884-1997 孔的一半或更多时，贝判断为杀菌阴性。B3. 3. 2.9 根据红色点状菌落数目的多少，以符号4.+记录试验结果。若补体及靶菌生妖对照各孔的细菌正常生长时，应出现众多红色点状菌落，可记为+十+。当所试各孔与其比较，菌落数减
30、少30%以下，记为.+十十;减少50%左右记为+j减少70%左右记为+I每孔少于10个菌落则记为士。e以细菌生长成呈+及以下者判断为杀菌阳性:以+及以上者判为杀菌阴性。以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度。C1 目的附录C(提示的附录)胶乳凝集试验应用胶乳凝集试验测定病人CSF、急性期血清和尿中Nm群特异抗原，辅助流脑临床诊断。C2 材料C2.1 10%胶乳颗粒(LatexParticles. Lx 1悬液，颗粒直径为O.81m. C2.2 从兔免疫血清中提纯的抗A、B和C群Nm的!gG。C2.3 在洁净玻璃板上，用红漆画两排红圈，其直径为3.5cm左右，漆干后备用。C2.4 p
31、H8. 2. O. 1 mol/L棚酸盐缓冲液。C2.5 BSA. C2.6 自明胶。C2.7 戊二醒。C2.8 叠氮俐。C2.9 怀疑流脑病人的CSF或急性期血清或尿液。C3 试验方法C3.1 兔抗不同群Nm的!gG致敏Lx.C3. 1. 1 将10%Lx悬液用棚酸缓冲液再稀释80倍。C3. 1. 2 取稀释的Lx悬液1个体积分别加等体积合适浓度的兔抗不同群Nm的!gG.置25mL容量的三角瓶中。C3. 1. 3 在37C水浴中旋转(120r/minl振荡瓶中的反应物，致敏Lx2 h.必要时可在每毫升Lx中加25%戊二醒1020L.这将有助于Lx吸附!gG。C3. 1. 4 离心致敏过的Lx
32、(3000 r/min.30 minl.用1mL吸管小心吸取上清液，计量后弃之z再加含有O.I%BSA的棚酸盐缓冲液(Borate-BufferedSolution Containing BSA .BSBl.混悬Lx.同上离心，弃上清，除去游离的!gG，照此重复洗涤Lx3次。C3. 1. 5 用BBSB液再将Lx恢复到致敏时的浓度，加叠氮锅至终浓度为0.1%.置4C备用36个月。C3. 1. 6 用正常兔!gG同上步骤致敏Lx作为阴性对照。C3. 2 以胶乳凝集试验检测疑似流脑病人标本内Nm群特异性抗原。C3. 2. 1 病人标本的处理，CSF离心(3000r/min.30 minl.取上滑，
33、沉淀部分作细菌培养$急性期血液(2mL).分离血清，暨56C将其灭活30min;急性期尿液5mL加20mL无水乙醇，置4C12 h.离心(3000 r/min.15 minl.弃上清，收集沉淀部分加0.25mL BBSB液将其溶解，同前离心，小心地吸取上清液待测，不要吸取尿中不溶解的沉渣。.) 1 ,1 GB 168841997 C3. 2. 2 用BBSB液将处理过的标本从1 2起连续借比稀释成不同的稀释度。C3. 2. 3 用9号针头分别吸取各稀释度标本2滴滴到玻璃板t的红圈内，其中1滴滴到k列排的红圈内，作为试验组，另1滴滴虫n列一排的红圈内，作为平行对照组。C3. 2. 4 往试验组的
34、红圈内各加l滴免疫的兔!gG致敏过的Lx悬液;往对照细的红圈内各加1滴正常兔!gG所致敏的Lx悬液。C3. 2. 5 轻轻地旋摇玻板，使标本与Lx充分混匀。C3. 2. 6 在1-2 min内即可见凝集，5mm时凝集更明显，此时可记录试验结果。C3. 2. 7 若只在试验组的红圈内出现明显凝集，但Lx本身与日BSB液以及在平行对照级的红圈内皆不出现凝集则判断为阳性反应。此时与阴性对照组比较.Lx;悬液变得较清完，Lx明显地聚集成较大的颗粒。C3. 2. 8 在主述病人标本中只要有一种标本与抗任何群Il11l的!gG所致敏的Lx发生明显凝集反应，贝lli昆明所检标本中含有Nrn相应群特异的抗尿，
35、即可辅助临床诊断为流脑。附录D(提示的附录)以PCR检测病人急性期血清或CSF中Nm的ONA特异片段01 目的应用PCR检查病人急性期血清或CSF中Nm的DNA特异片段，对流脑病人进行早期诊断。02 材料02.1 疑似流脑患者的CSF或急性期血清。02.2 Nm的模极DNA和正常人血清作为对照。D2.3 4XdNTPo D2.4 坊、脂糖。1 2.5 I真化乙院。D2.6 Taq酶(Promega)。D2.7号|物1为，5ATTATTCAGACCGCCGGCAG3, 引物2为5CCGATAATCAGGCATCCG3。D2.8 液体石蜡。12.9 元菌去离于一水。02.10 紫外光检测器。D2.
36、11 PCR扩增仪。D2.12 10XPCR反应缓冲液500mmol斤，KCl, 100 mmol!L Tris-HCl, 2. 14 1 X TBE电泳缓冲液20.089 mol/L Tris-H3BO, 0.002 mol/L EDTA 02.15电/Jj仪。02.16分子f:标准.DNA -EcoR 1 !Hind m。GB 16884-1997 D3 扩增程序在O.5 mL Eppendorf管中分别加入:反应物加样顺序体积(L)终浓度10X缓冲液4XdNTP混合物引物1号|物2模板ONA或待检标本(标本需95C加热5min预处理)无菌去离子水(95C水浴10min，快速离心30s)
37、1 2 3 4 5 6 5.0 4. 0 2.5 2. 5 5.0 30. 5 lX缓冲液200mol/L每种dNTP 1mol/L Imol/L 5.0 ng ONA/L Taq ONA聚合酶7 O. 5 1 u 液体石蜡8 25.0 D3.1 混匀离心，于72-C反应2min后即开始循环。循环参数如下:94 C变性反应30的56C退火反应30S; 72-C延伸反应60So D3. 2 30个循环后再72C延伸4mino D3. 3 反应结束，取出反应管冷至室温后置4C供检测。D4 扩增产物的检测lD4.1 取2L反应产物与1L载样缓冲液混合。D4.2 用含澳化乙睫(0.5g/mL)的1.2
38、%琼脂糖凝胶检测扩增产物。D4.3 75 mmX48 mm微型胶，以6V/cm电泳1h，电泳缓冲液为1XTBE。D4.4 电泳结束后，将凝胶置紫外光检测器上观察结果、照相。D4.5 扩增产物特异片段的长度为596个碱基对。附录E(提示的附录)流行性脑脊髓膜炎治疗原则E1 普通型E1.1 一般治疗卧床休息，流质饮食，必要时鼻饲或静脉补液。E1.2 对症治疗高热、头痛、呕吐、烦躁或惊厥等，应分别给予相应处理。E1.3病原治疗轻症病例首选50，疑对磺胶过敏或耐药者应改换其他药物如青霉素或氯霉素。E 1. 3. 1 磺胶嗜睫(50):成人68g/d，小儿。.150. 2 g/(kg d)，每日总量不超
39、过8日，加等量碳酸氢销分341次服用，首J加倍。频繁呕吐或不能口服者，应改为注射，50为首选。成人46g/d.小儿。1O. 15 g/(kg d).分231次肌注或静脉滴注，其浓度应小于5%。另可用5MZ-TMP(复方新诺明，每片含5M2400 mg、TMP80 mg)，成人每8h服2片。小儿5MZ50 mg/(kg. d) ,TMP 10 mg/(kg. d).分2次口服。,11 G GB16884一1997E1. 3. 2 青霉素:单用青霉素，成人(8002000)万u/d，小)L(2040)万u/(kgd)，分34次静脉滴注，疗程5.7天。E1. 3. 3 氯霉素对磺胶、青霉素过敏者或耐
40、药者可选用。成人24g/d，小儿50100 mg/(kg d) , 分34次静脉滴注，疗程57天，新生儿禁用。使用过程中注意观察骨髓抑制情况。E1. 3. 4 氨节青霉素，适用于病情较重和病原不明者。成人46g尬，小儿150300mg/(kg d)，分23次静脉滴注，疗程57夭。注意副作用。E1. 3. 5 头抱氨喽恬(Cefotaxime)肌注(静脉滴注).成人28g/d，儿童50200mg/(kg d)，分24次给药，或头拖喽肪三嚓CCeftriaxonc)每日用药一次，成人24g加到5%葡萄糖溶液50100 mL 静脉滴注。儿童肌注15200mg(平均46mg)/峙。此两种抗生素仅适用于
41、不能应用青霉素和氯霉素的重症患者。E2 休克型E2.1 病因治疗:首选青霉素，剂量(2040)万u/(kg d)，多与氯霉素联合用药，病情好转后用法同普通型。E2.2 抗休克治疗E2. 2. 1 补充血容量(扩容)可选用低分子右旋糖苦，成人500时，静脉内i商注，24h不超过1000 mL，可根据中心静脉压、尿量调整补液速度。E2. 2. 2 纠正酸中毒:成人先给5%碳酸氢纳200mL，后根据血生化检查结果而定。E2. 2. 3 血管活性药2扩充血容量和纠正酸中毒后，若休克仍未纠正，可应用血管活性药lll1l!:在碱，剂量。.30. 5 mg/(kg .次)(儿童剂量酌增)，每1020min静
42、脉推注1次。待面色红润、微循环改善、尿量增加、血压回升后，即可延长给药时间。若应用山皮辈革碱疗效不好，病情有加重趋势，可改用多巳股。亦可开始即首先选用多巴胶1020mg加入100mL 5%10%葡萄糖溶液中静脉滴入。拜始以75100月/min的速度滴入，血压回升后逐渐调慢滴速。临床上以紫钳消失、面唇转红、脉搏有力、血压平稳、尿量增多等作为停药指征。E2. 2. 4 抗凝治疗:如出现DIC应使用肝素治疗，剂量。51 mg/(kg .次)，加入10%骨i匈糖溶液40100 mL内静脉滴注。必要时每46h重复一次.般用药23次。每次用药前，需以试管法测定凝血时间，使凝血时间保持在1530mino 重
43、症休克时纤维蛋白溶酶增多，使血管内纤维蛋白溶解而加重出血，故治疗大片出血汗.可先应用肝素，首次剂量为1mg/kg溶入20mL 10%的葡萄糖溶液或生理盐水中静脉推注，继以1mg/kg 浴入10%葡萄糖溶液或生理盐水50100mL中.专用一个点滴瓶，在4h内缓慢滴完。用肝素24次、工即见效，用药时间一般不超过24h。然后再用6氨基己酸6日(儿童用量12g/次)加于10%葡萄糖液100 mL中静漓，JQ，、要时46h重复一次。E2. 2. 5 肾上腺皮质激素(激素):其抗休克作用至今尚无定论。氧化考的松，成人用量300mg/d，小儿1015 mg/(kg. d)，分23次静脉滴注。或地塞米松，成人
44、剂量为2030 mg/d，小儿为O.5 mg/ (kgd)，分23次，静脉滴注。E3 脑膜脑炎型E3.1 抗菌药物的应用同前，治疗重点为减轻脑水肿，防止脑捕和呼吸衰竭。E3. 2 脱水剂应用:以20%甘露醇为主，剂量12日/(kg.次)。根据情况每46或8h静脉快速滴注(30 min内注完)或推注。脱水剂用至颅内压增高症状好转，即可逐渐减量或延长给药时jEl flJ完全停药需23夭。如出现脑店，可给速尿2040mg加入20%甘露醇或25%山梨醇内静脉滴注。E3. 3 肾上腺皮质激素的应用同前。E3. 4 呼吸衰竭用呼吸兴奋剂如山梗菜碱、可拉明、利他林或因苏灵等。吸氧、吸痰、保持气道通畅如GB
45、16884 1997 呼吸骤停，立即喉插管，或气管切开，行人工呼吸。E4 混合型应根据病情，参照休克型及脑膜脑炎型治疗。附录F提示的附录)流脑预防的原则流脑是由Nm经空气飞沫传播而引起的种急性传染病，病死率高，具有季节性发病高峰，在高发地区还具有周期性流行的特点。儿童发病率比成人发病率高，90%以上的病例是由A、B和C群Nm引起的。虽然目前在我国由B群Nm致病有所增多，但仍以A群Nm引起的病例最多见。Nm感染性强，人被感染后大多表现为鼻咽部带菌状态或出现上呼吸道轻度炎症，只有少数受感染者发展为流脑病人。A群Nm可以引起世界范围的流脑大流行，而B群和C群Nm主要引起局部地区流行或散发。人被Nm感
46、染后可以获得一定的免疫力。尽管Nm感染性强，但它对外界的抵抗力较弱，在外环境中存活能力差。因此对流脑的预防应采取以注射菌苗为主的综合防治措施，重点预防的对象是易感人群。F1 平时的预防措施F1. 1 开展群众性的卫生运动，预防此病传播。搞好居民居住地方、托儿机构、中小学校、厂矿、工地、商场和影剧院等场所的卫生状况，对减少流脑的播散具有重要意义。因此在此病流行前期要有计划地开展几次群众性卫生运动，清扫周围环境与室内卫生，注意通风、换气、勤晒衣被和儿童玩具。F1. 2 加强体育锻炼和营养，增强体质，提高机体抵御疾病的能力。F1.3 宣传防治流脑的科普知识，增强广大群众预防流脑的意识，使病人能得到早
47、发现、早报告、早诊断、早隔离治疗并使疫点得到早处理。F1.4 坚持做好流脑流行病学监测。F1. 4. 1 疫情监测:F1. 4.1.1 建立健全的流脑疫情报告网，经常检查疫情报告和漏报的情况，提高疫情报告的质量。F1.4.1.2 与过去做比较，分析疫情升降水平和发病的趋势。F1.4.1.3 比较病例年龄组百分构成比例的变化。F1. 4.1.4 分析病例地区分布的特点，散发、局部暴发或地区流行。流行时疫情扩散的路线与范围以及本地与毗连地区发病的关系。F1. 4. 2 病原学和血清学监测:F1.4.2.1 收集疑似流脑病人CSF或急性期血分离培养Nm或检测Nm群特异抗原，并保存菌株供鉴定菌群与菌型
48、。若能收集到病人急性期尿标本，也可用于检测Nm群特异性抗原。F1. 4. 2. 2 在病人入院和出院时分别采取急性期和恢复期血测定血清抗体水平，可以对流脑病人进行追溯珍断。F1. 4. 2. 3 于流行前期在监视IJ点内对2岁以下幼儿、学龄前与学龄儿童及成人抽样检查健康人群中Nm带菌情况，并保存部分带菌者菌株供进一步分型。F1. 4. 2. 4 群体免疫水平的监测:在检查Nm带菌的同时采取血液标本，分离血清，用ELISA法测定上述不同年龄组人群抗体水平。F1. 4. 3 开展流脑监测时须注意其他呼吸道传染病的发病情况以及自然条件与社会环境的特殊变化。F1. 4.4 调查过去菌苗注射的情况及其预防效果。F1.4.5 根据以上监测结果，分析流脑发病趋势，制定预防工作计划，落实茵茵预防及病人抢救治疗的二IHGB 16884一1997措施。F1.5 在流脑散发情况fA群脑膜炎双球菌多糖茵茵的常规免疫，于每年11月或12月对满6个月至2岁以下儿童进行基础免疫2针，其间隔时间为一个月。以后在第2和第3年再各加强免疫I钊。儿童接种率须达到80%90%，菌苗注射的剂量和部位等具体使用方法请遵照说明书的规定。F2 流脑疫惰的处理流脑疫情的处理包括散发以及局部暴发或流行时疫情的处理。F2.1 散发疫情的处理F2. 1. 1 在采取上述措施的基础上认真做好流脑病人就地
