1、ICS 65.020.30 B 43 道自中华人民共和国国家标准山羊冷冻精液Frozen semen of goat 2006-09-04发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会GB 20557-2006 2006-12-01实施发布中华人民共和国国家标准山羊冷冻精液GB 20557-2006 9峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峙开本880X12301/16 印张l字数25千字2006年12月第一版2006年12月第一次印刷* 书号:15
2、5066 1-28579 定价12.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB 20557-2006 目次前言.皿1 范围.2 规范性引用文件-3 术语和定义4 要求-4. 1 种公羊.4.2 新鲜精液24. 3 冻精外观24.4 冻精解冻后的要求-5 抽样5.1 抽样检验方案.5. 2 抽取样本.2 6 试验方法26. 1 外观26.2 解冻后冻精.6. 3 检验分类-6. 4 检验项目7 判定规则7. 1 常规检验.3 7.2 型式检验37.3 抽样检验对群体质量水平的判定38 标志、包装、运输、贮存38.1 标志8. 2 包装8. 3 运
3、输8.4 贮存.3附录A(规范性附录)山羊冷冻精液质量检验方法4人1导言 4 A.2 冻精解冻. 4 A. 2.1 器材、榕液4A. 2. 2 方法 4 A.3 精子活力检查 4 A. 3.1 器材、溶液4A. 3. 2 方法 4 A. 3. 3 计算 4 A.4 前进运动精子数的检查 4 A. 4.1 器材、溶液.4 A. 4. 2 方法A. 4. 3 计算A.5 精子畸形率的检查GB 20557-2006 A. 5.1 器材、榕液A. 5. 2 方法A. 6 细菌数的检查A. 6. 1 器材、榕液A. 6. 2 培养基A. 6. 3 操作步骤A. 6. 4 菌落计数方法A. 6. 5 平板
4、菌落数的计算附录B(规范性附录)山羊冷冻精液质量监督抽样检验程序.8 旦1导言.8 B.2 质量监督抽样检验程序.8 B. 2. 1 监督总体8B.2.2 确定质量特性8B. 2. 3 监督质量水平.8B.2.4 监督检验等级.8 B.2.5 检索监督抽样方案.8 B.2.6 抽取样本.8 B. 2. 7 检验样本.8 B.2.8 判断监督总体是否通过.8 B. 2. 9 应用实例. 8 附录C(资料性附录)山羊冷冻精液制作程序和使用C.1 采精.9C.2 稀释液配制9C.2.1 所有器具应洁净并消毒灭菌. . 9 C.2.2 化学试剂9C. 2. 3 稀释液9C.3 精液稀释与分装.9 C.
5、 3.1 一次稀释法.9 C. 3. 2 二次稀释法9C. 3. 3 细管精液的分装.9 C.4 降温、平衡. 9 C.4.1 降温9C. 4. 2 平衡. . 10 C.5 精液冷冻. 10 C.5.1 冷冻用具. 10 C. 5. 2 细管冻精. . . . . . . . . . . 10 C. 5. 3 颗粒冻精. 10 C. 5. 4 液氮 10 C.6 精液解冻. 10 C.7 输精. 10 C. 7. 1 开腹器输精法 a. 10 C. 7. 2 注意事项四E GB 20557-2006 前言本标准的第4章是强制性的，其余是推荐性的。本标准的附录A、附录B是规范性附录，附录C是资
6、料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(南京人农业部全国畜牧兽医总站。本标准主要起草人:金穗华、陆汉希、王志刚、黄文佳、赵文魁。本标准委托农业部牛冷冻精液质量监督检验测试中心(南京)负责解释。mM GB 20557-2006 山羊冷冻精液1 范围本标准规定了山羊冷冻精液的命名、种公羊和新鲜精液与冷冻精液技术要求、抽样、试验方法、判定规则和标志、包装、运输、贮存。本标准适用于山羊冷冻精液也可霄称冻精勺。2 规范性引用文件3.1 3.3 3.4 3.5 下列术t精子畸形率abnoi可畸形精子占总精子数
7、细菌数bacteria count 每剂量精液经培养后观察到的细菌菌落数。冷冻、精液frozen semen 经特殊方法处理的精液超低温冷冻后在液氮中(-1960C)长期保存。4 要求4. 1 种公羊(AQlL)检索的逐批检验抽样应具有种用价值，体质健康，无遗传病，不允许有已发布的动物防疫法中所明确的二类疫病中的任何一种疾病。GB 20557-2006 4.2 新鲜精液色泽乳白色或1炎黄色。精子活力二三65%，精子密度二三6X 108个/mL，精子畸形率15%。4.3 冻精外观4.3. 1 细管细管无裂痕，两端封口严密，印制的标志清晰。4.3.2 颗粒颗粒大小均匀，表面光滑。4.4 冻精解冻后
8、的要求4.4. 1 活力活力30%。4.4.2 前进运动精子数前进运动精子数二三3X 107个。4.4.3 精子畸形率精子畸形率20%。4.4.4 细菌数细菌数运800个。5 抽样5. 1 抽样检验方案5. 1. 1 生产方抽样检验生产方和使用方为质量保证概率把关，按照GB/T15239-1994中的第5章，采用LQ=8，模式A抽样方案检索一次抽样方案确定抽检公羊(冻精)的样本量。5. 1. 2 质量监督抽样检验质量监督抽样检验按照GB/T15482-1995中的第5章，该群体公羊(冻精)为一监督总体，采用Do =10，用第二检验等级抽样方案确定抽检公羊(冻精)的样本量，其抽样检验程序见附录B
9、。5. 1. 3 复检和仲裁检验复检根据原抽样方案确定，仲裁需抽样按照5.1. 2规定方案和7.3.2的判定规则。5.2 抽取样本抽取样本见附录B.2. 6。6 试验方法6. 1 外观用目测法，其结果应符合4.3的规定。6.2 解冻后冻精解冻方法及精子活力、前进运动精子数、精子畸形率、细菌数的检验按附录A规定的方法，其结果应分别符合4.4中的规定。6.3 检验分类6.3.1 常规检验冻精产品的单项检验，是型式检验中的一部分，主要是在每生产批入库前和销售出站前的检验。6.3.2 型式检验味精产品全项目检验，是评定产品质量是否符合标准，在生产方抽样检验、质量监督抽样检验和复检、仲裁检验时所选定的检
10、验。2 GB 20557-2006 6.4 检验项目检验项目和检验周期见表1。表1检验项目、周期检验类型检验项目要求中章、条试验方法中章、条检验周期常规检验外观、解冻后活力4. 3、4.4.16. 1、6.2 每生产批人库、出站。外观、解冻后活力、呈生产方为质量保证每两个月为型式检验前进运动精子数、畸4.3 6. 2 一抽检周期，在周期内进行一次4. 4. 14. 4. 4 形率、细菌数7 判定规则7. 1 常规检验样品所检验项目中任何一项不合格，则判为不合格。7.2 型式检验样品所检验项目中任何一项不合格，则判为不合格。7.3 抽样检验对群体质量水平的判定7.3. 1 生产抽样检验的判定抽检
11、该群公羊(冻精)质量水平。质量监督检验可为不定期。引用GB/T2828. 12003第3章中Ac-接受数，Re一一拒收数，d一一不合格品数。通过对抽取样本检验按GB/T15239-1994中5.11的规定，当dAc，则判可接收，当dRe则判不可接收。7.3.2 质量监督抽样的判定通过对抽取样本检验按GB/T15482-1995中5.9的规定，当dr(不通过判定数)，则判为可通过，当d二三r.则判为不可通过，见附录B.2.8o8 标志、包装、运输、贮存8. 1 标志8. 1. 1 晶种种公羊的品种可用代号。代号为该品种第一、第二个汉字的汉语拼音大写字母。示例:波尔羊的品种代号咆BE8. 1.2
12、内寄细管冻精应在管壁(或包装袋)上印制以下内容并且印制标志要清楚。a) 生产站名;b) 公羊品种;c) 公羊号;d) 生产日期。8.2 包装细管冻精用专用的塑料管25支包装，颗粒冻精用灭菌纱布袋，每一包装量颗粒不得超过100粒。8.3 运输冻精运输过程中应有专人负责，贮存容器不得横倒及碰撞和强烈振动，保证冻精始终浸在液氮中。8.4 贮存贮存冻精的低温容器应符合GB/T5458规定;专人负责及时补充液氮，冻精应浸在液氮中;每只公羊的冻精单独贮存;贮存冻精的容器每年清洗、消毒应不少于一次并更换新鲜液氮;取放冻精时，冻精离开液氮的时间不得超过10s。3 GB 20557-2006 A.l 导言A.
13、2 冻精解冻A. 2.1 器材、溶液用50L旗、下观察活力，环塘、观察3个视野，注，A. 3. 3 计算精子活力按式(A飞d式中:M一一精子活力;nj一一第一视野活力;向第二视野活力;n3一一第三视野活力。A. 4 前进运动精子数的检查A. 4.1 器材、溶液附录A(规范性附录)山羊冷冻精液质量检验方法200400倍显微镜 ( A.l ) 血球计数板、血色素管、2mL吸管、小试管、计数器、显微镜或显微电视装置、滴管、3.0%氯化铀榕液。4 A. 4. 2 方法A. 4. 2. 1 稀释精液制备A. 4. 2. 1. 1 颗粒GB 20557-2006 用血色素管准确吸取10L解冻精液，注入盛有
14、1.99 mL的3.0%氯化铀搭液的试管内，混匀，使之成为200倍稀释的稀释精液。A. 4. 2. 1. 2 细管用血色素管准确吸取10L干解冻精液，注入盛有0.99mL的3.0%氯化铀溶液的试管内，11昆匀，使之成为100倍稀释的稀释精液。A.4.2. 2 计数将血球计数板用血盖计数室，均匀充满不能两个计数室，取平均A. 4. 3 计算a) b ) 每百式中:A. 5. 1 器材、南显微镜、载玻A.5.2 方法A. 5. 2.1 溶液配制磷酸二氢铀(NaHzP04 2m 磷酸氢二铀(NazHP04 12Hz ) 双蒸馆水定容至100mL A. 5. 2. 1. 2 中性福尔马林固定液25位中
15、方梅的总精子数)X 10(1 mm3 )或旭OO(细管稀释倍数)X剂. ( A.2 ) 铀、磷酸氢二纳、甲醒、甲0.55 g 2.25 g 40%甲醒HCHO(使用前每100mL甲醒用10.0g碳酸镇饱和后过滤)磷酸二氢铀(NaHzP04. 2Hz) 8.0 mL 0. 55 g 磷酸氢二锅(NazHP04 12Hz) 2. 25 g 用0.89%氯化铀约50.0mL溶解后加入8.0mL中和后的甲醒，再加0.89%氯化铀溶液定容至100. 0 mL。A. 5. 2. 1. 3 姬姆萨原液姬姆萨染料1. 0g 5 GB 20557-2006 甘油C3H5 (OH)3J 66.0 mL 甲醇(CH
16、30H)66.0 mL 姬姆萨染料放入研钵中加少量甘油充分研磨至无颗粒为止，然后将甘油全部倒入并放入恒温箱中保温继续溶解4h，再加甲醇充分溶解棍匀，过墟后贮于棕色瓶中待用，贮存时间越久染色效果越好。A. 5. 2. 1. 4 姬姆萨染液姬姆萨原液磷酸盐缓冲液蒸铺水现配现用。A.5.2.2 制片染色A. 5. 2. 2.1 抹片2.0 mL 3.0 mL 5.0 mL 取解冻后精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈35。夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干(约5min)。A.5.2.2.2 固定在已风干的抹片上滴上1.0 mL2. 0 mL中性福尔马林固定液，固定
17、15min后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干。每样品制作两个抹片。A.5.2.2.3 染色将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5h后用清水缓缓冲去染液，晾干待检。A. 5. 2. 3 镜检将制备好的抹片在显微镜(1000倍油镜)下观察。每个抹片观察200个以上的精子(分左、右两个区)，取两片的平均值，两片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片。A. 5. 2. 4 计算精子畸形率按式(A.3)计算:式中:A一一精子畸形率，%;Al一一-畸形精子数，单位为个;5 精子总数，单位为个。A.6 细菌数的检查A. 6
18、.1 器材、溶液A=生X100 5 .( A. 3) 培养箱、超净化工作台、三角烧瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、羊角匙、高压蒸汽灭菌锅(或微波炉)、培养皿、水浴箱、pH试纸(pH5.59. 0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、放大镜、蒸馆水、营养琼脂培养基。A.6.2 培养基营养琼脂培养基:按GB/T4789.2-2003中5.1规定。A.6.3 操作步骤A. 6. 3.1 样晶的制备及培养A. 6. 3. 1. 1 颗粒以无菌操作，将所检样品一粒直接放于灭菌平皿内，自然解冻后待用。同样品制两个平皿。6 GB 20557一2006A. 6. 3. 1.2 细管以无菌操作，用酒精棉球擦抹解冻后
19、的细管外壁，剪掉超声波封口端，一支精液直接注入一个灭菌平皿内。同一样品制两个平皿。A. 6. 3.1.3 平皿样品移入平皿后，应及时将凉至46.C营养琼脂培养基(可放置于46.C士1.C水浴保温)注入平皿约15 mL，并转动平皿与精液样品混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入另一灭菌平皿内作空白对照。A. 6. 3. 1.4 培养待琼脂培养基凝固后，翻转平皿，置36.C士1.C恒温箱内培养48h土2h. A.6.4 菌落计数方法做平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板菌落数后，求出同一样品两个平板的平均菌落数。A.6.5 平板菌落颤的计算所检样品的细菌菌落数按式(
20、A.的计算:式中:B一一细菌数，单位为个;nj一一第一平皿菌落数，单位为个;nz一一第二平皿菌落数，单位为个。.(A. 4) 7 GB 20557-2006 附录B(规范性附录)山羊冷冻精液质量监督抽样检验程序B.l 导言本附录给出了通用的山羊冷冻精液质量监督抽样检验程序，对这样的特定对象产品，通过质量监督抽样检验对在群山羊(冻精)产品质量水平评价。B. 2 质量监督抽样检验程序B.2.2 确定质量特性每只山羊(冻精)质量却川，B. 2. 3 监督质量水平，、，B.2.5 检索监督抽在GB/T15482 读出监督抽样方案。fB. 2. 6 抽取样本样本应在监督总椿(一数，并在群体中山羊按批中冻
21、精。B. 2. 7 检验样本按照规定的检验项B. 2. 8 判断监督总体是m根据监督质量水平和监P民程flL!.电. 结果在样本中不合格品数d二三r.miM(冻精)通过。B.2.9 应用实例质量监督抽查需要评价某种羊场一的样本(只)取出一生产Do =10.用第二监督检验等级，由GB/T15482-7精节歪得监督抽样方案为n=2.r=2.该群种山羊中应抽检样本是2只山羊(冻精).按样本数在群体中随机确定2只样品山羊并在其冻精贮存罐中取出一生产批中冻精，按规定的项目检验，若样本中不合格品数d不小于不通过判定数r.即d二三r.则判该群山羊(冻精)不通过;如果样本中不合格品数d小于不通过判定数r.即d
22、r.则判该群山羊(冻精)通过。8 GB 20557-2006 附录C(资料性附录)山羊冷冻精液制作程序和使用C.l 采精采精前洗净公羊下腹部，并用灭菌生理盐水冲洗包皮内腔，进入采精场地对公羊给予充分的性准备时间并空爬1次2次，采精频率每星期4次5次，成年公羊每次可连采两回，但间隔时间要在O.5 h 以上。C.2 稀释液配制C.2.1 所有器具应洁净并消毒灭菌C. 2. 2 化学试剂所用化学试剂(化学纯以上):拧朦酸三锅、果糖、煎糖、乳糖、甘油，鸡蛋用健康鸡场的新鲜鸡蛋，双蒸水。C. 2.3 稀释液C. 2.3.1 绵羊用稀释灌细管一液:拧攘酸铀3.0g、葡萄糖3.0g加蒸馆水至100.0mL，
23、卵黄25.0mL。二液:取一液88.0mL，甘油12.0mL。颗粒11%乳糖液75.0mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。C.2.3.2 山羊用稀释液基础液:拧攘酸铀1.5g、葡萄糖3.0g、乳糖5.0g加蒸馆水至100.0mL，消毒待用。取消毒后的基础液75.0mL，卵黄20.0mL，甘油5.0mL。所有稀释液每100.0mL中添加青霉素、链霉素各10万单位，现配现用。C.3 精液稀释与分装C. 3. 1 一次稀释法将需加的稀释液一次加完。C. 3. 2 二次稀释法将所加稀释液分为两次添加，首先加入不含甘油的一攘，加至稀释总量的一半，降温、平衡后再加足含有甘油的二液。添加与精液等温的稀释
24、液时应缓缓加入。C. 3. 3 细管精液的分装C. 3. 3. 1 细管为无毒、耐低温的专用塑料管。C.3.3.2 平衡前在室温下或平衡后在30C50C环境下均可分装，管内需留一定的空隙。C.3.3. 3 分装后两端封口应严密。C.3.3.4 微型分装管的精液量二三0.18mL，中型管二三0.40mL。C.4 降温、平衡C. 4.1 降温精液稀释后经1h左右逐步降温至30C50C。CON-hmmON筒。GB 20557-2006 C. 4. 2 平衡时间为3h 4 h。精液冷冻C. 5.1 冷冻用具需洁净后消毒。C. 5. 2 细管冻精用铜网或细管架熏蒸。C. 5. 3 颗粒冻精用铜网或氟板滴冻，剂量0.1mL:i: O. 01 mL。C. 5. 4 液氮作为冷源，热平衡温度为一800C一1l00C，细管熏蒸8min、颗粒熏蒸2min后浸入液氮。C. 5 精液解冻C.6 解冻液及解冻方法参照A.1规定进行。输精C. 7. 1 开腥器输精法要求慢插、适深、轻注、缓出。C. 7. 2 注意事项应注意输精过程中的卫生要求。C. 7 侵权必究书号:155066 . 1-28579 12.00元铃版权专有定价:GB 20557- 2006
