1、ICS 6502030B 41 a亘中华人民共和国国家标准GBT 1580512008部分代替GBT 158051 1995鱼类检疫方法第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)Quarantine methods of fishPart 1：Infectious pancreatic necrosis virus(IPNV)2008-07-3 1发布 20081101实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局世士中国国家标准化管理委员会及仲刖 罱GBT 15805(鱼类检疫方法分为下列部分：一第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)；第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)第3部分：病毒性
2、出血性败血症病毒(VHSV)第4部分：斑点叉尾鲴病毒(CCV)；第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)；第6部分：杀鲑气单胞菌；第7部分：脑粘体虫；GBT 1580512008本部分为GBT 15805的第1部分。本部分代替GBT 158051 1995淡水鱼类检疫方法第一部分中的第3章。本部分与GBT 158051 1995的第3章相比主要变化如下：一一一增加了用ELISA方法鉴定IPNV；结构格式按GBT 11-2000的规定，作为部分编写。本部分的附录A为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：农业部全国水产技术推广总站、中华人
3、民共和国深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 1 580511995。鱼类检疫方法第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)GBT 15805120081范围GBT 15805的本部分规定了用中和试验和酶联免疫吸附试验检测传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的方法。本部分适用于IPNV的分离与抗原的鉴定，IPN的流行病学调查、诊断、监测以及口岸出入境、国内跨区域移动的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容
4、)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 6682-。1992分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)GBT 18088-2000出入境动物检疫采样3试剂和材料31 水：GBT 6682 1992，二级。32酶标羊抗兔IgG：按说明书使用。33 IPNV参考株：由农业部指定的动物病原微生物菌(毒)种保藏机构提供。34阴性对照：正常细胞组织悬液。3。5 IPNV参考抗血清。36羊抗IPNV抗体。37硫酸：分析纯。4器材和设备41 96孔细胞培养板。42酶标板。4
5、3酶标测定仪。44微量移液器。45倒置显微镜。46恒温培养箱。47普通冰箱和低温冰箱。48组织研磨器。49离心机和离心管。410消毒设备。5 IPNV的分离51采样按GBT 18088 2000的规定执行。对有临床症状的鱼，体长4 cm的鱼苗取整条，若是带卵黄1GBT 1580512008囊的鱼应去掉卵黄囊。体长4 cm6 cm的鱼苗取内脏(包括肾)；体长大于6 cm的鱼则取肝、肾、脾。对无症状的鱼取肝、肾、脾；成熟雌鱼还需取卵巢液。鱼卵则取卵壳。52样品处理应在10以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆，匀浆后，再用含有适量抗菌素(1 000 IumL的青霉素和l 000“gmL的链霉素或其他抗
6、菌素)的细胞培养液(见第A1章)，按1：10的最终稀释度悬浮。于15下孵育2 h4 h或4下孵育6 h24 h。7 000 rmin离心15 rain，收集上清液。卵巢液不必匀浆，稀释两倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。53分离操作对上述1：10的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100和1：1 000三种稀释度的上清液，用无菌操作方法，以适当体积分别接种到生长约24 h的RTCr2、CHSE或者PG细胞单层中，每孔(2 cm2)的细胞单层最多接种100 pL稀释液。1520吸附1 h后，加入细胞培养液。置于182培养。阳性对照
7、组和待测样品都接种细胞后，7 d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查，接种了被检物匀浆上清稀释液的细胞培养中是否出现细胞病变(CPE)。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7 d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物。7 000 rrain，4离心15 min，收集上清液。接种到新鲜细胞单层，培养7 d。每天用40倍100倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。如有CPE出现，则要用中和试验或者ELISA方法进行鉴定是否由IPNV引起。如果在阳性对照组也未出现CPE，则试验无效。应采用敏感细
8、胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病毒学检查。6 IPNV的鉴定I：中和试验61试验准备611把RTG-2(或CHSE、PG等)细胞培养于96孔微量细胞培养板上。612病毒：用IPNV参考毒株，传代后制成病毒悬液。613抗血清：抗IPNV的参考血清，使用前于56灭活60 min。614待检样品(出现了CPE的细胞培养物)：冻融一次，除去细胞碎片后使用。62操作步骤621 将待检样品用细胞培养液作系列稀释，使其稀释度由10_1到10 ，每管体积为05 mL。622取两排试管，分别从上述各稀释度的待检样品中取出02 mL于两排试管中，然后第一排管加入02 mL抗IPNV参考血清，第二排管加入0
9、2 mL细胞培养液，充分混合均匀。623 25温育60 min。624温育后分别将第一排管与第二排管的样品接种于已长满细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度4孔，每孔01 mL。625将抗IPNV参考血清倍比稀释后(1：8至1：64)接种于上述培养板，每个稀释度2孔，每孔005 mL，作为参考抗血清对照。626将IPNV参考病毒按照621623的方法由10_1到10_8稀释，并和参考血清混合反应后加入细胞板，每个稀释度2孔，每孔01 mL，作为“参考病毒+参考血清”对照，细胞板中剩余8孔中4孔作正常细胞对照，4孔接参考病毒原液做病毒对照。627各孔再加入细胞培养液01 mL。628放入20
10、培养箱中培养，逐日观察病变，按表1填写试验结果。2表1 中和试验结果记录表GBT 1580512008待检样品+参考血清 待检样品+细胞培养液 参考病毒+参考血清 参考m清 对照项 目1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A lO一1 1：8细B lO一2 1：8 胞对C 103 1：16照D 104 1：16E 105 1 2 32病F 106 1：32毒G 10 7 1：64 对照H 10 s 1：6463结果计算按ReedMuench法分别计算出“待检样品+参考血清”以及“待检样品+细胞培养液”的细胞半数死量(TCIDs。)，二者的滴度指数之差的反对数即为中和指数。若正常细
11、胞与参考血清对照为阴性，标准毒对照为阳性，“参考病毒+参考血清”中血清能有效抑制病毒产生CPE，则按表2判定结果。表2中和试验结果判定表中和指数 结果判定50 阳性7 IPNV的鉴定：ELISA法71包被羊抗1PNV抗体将羊抗IPNV的IgG用包被稀释液(见第A2章)稀释成工作浓度后包被酶标板，每孔01 mL。4孵育12 h24 h或者37反应15 h2 h。倒出孔内液体。72洗涤将PBsT(见第A3章)加满tJ,iL，2 min后倒出，拍干。如此重复3次。73加入待测样品每个样品两孔，每孔01 mL。另将已知IPNV参考毒株(阳性对照)、正常组织样品(阴性对照)和细胞培养液(空白对照)也各加
12、两孔。37反应15 h2 h。倒出孔内液体。用PBST洗3次，方法见72。74加入兔抗IPNV血清每孔加01 mL稀释到工作浓度的兔抗IPNV参考血清(用细胞培养液稀释)。37反应15 h2 h。倒出孔内液体。用PBST洗两次，方法见72。75消除非特异性过氧化物酶每孔加01 mL 01的H202(用双蒸水稀释)。37反应15 min以除掉非特异性的过氧化物酶。倒出孔内液体。用PBST洗两次，方法见72。76加入酶标羊抗兔lgG结合物(酶标二抗)每孔加入01 mL稀释到工作浓度的酶标羊抗兔IgG(用细胞培养液稀释)。37反应15 h2 h。倒出孔内液体。用PBST洗3次，方法见72。3GBT
13、158051200877加底物OPD溶液溶液配制见第A4章。每：fLJII入01 mL OPD溶液。78加终止液当阳性对照出现明显棕黄色，反应。室温下避光反应显色约10 rain。阴性对照无色时，立即每孔加入02 mL浓度为2 molL硫酸终止79结果计算和判定当ELISA反应结束并加入终止液后，10 rain内用酶标仪测量各孔在490 nm波长时的光吸收值(Am值)。以空白对照的Aa。o值为零点。先计算阳性对照和阴性对照的At90值之比。阳性对照孔的At90值(P)与阴性对照孔的A490值(N)之比大于21(即en21)，表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的A490值之比。当样品孔的
14、At。o值(P)与阴性对照孔的At。o值(N)之比大于或等于21(即PN21)时定为IPNV阳性。8综合判定81经细胞培养出现CPE，并经中和试验或者ELISA检测为阳性者，若出现I临床症状，可判定患有传染性胰坏死病；若无临床症状，判定为IPNV携带者。82仅有临床症状，或仅能在细胞培养中出现CPE，但不能被抗IPNV中和抗体中和或者ELISA检测为阴性则不能称患有IPN，需进一步作其他病检查。83若中和试验为可疑，则需要重复一次，结果如果仍为可疑则判为可疑，或者改用ELISA方法鉴定。4GBT 15805卜一2008附录A(规范性附录)试剂配制标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试
15、剂。A1细胞培养液TCl99培养基，按说明书的要求配制，然后加入10的胎牛血清，抽滤除菌后分装，-20保存。A2包被稀释液(pH96)碳酸钠(NazC03) 159 g碳酸氢钠(NaHCOa) 293 g水 1 000 mL充分搅拌溶解后，4保存。A3 PBST(pH74)氯化钠(NaCl) 8 g氯化钾(KCD o2 g磷酸二氢钾(KHzP04)02 g十二水磷酸氢二钠(NazHP0412H20) 29 g水 1 000 mLTween-20 005 mL摇匀后，4保存。A4底物OPD溶液(pH50)01 moLL磷酸氢二钠(NazHP04) 600 mL01 moLL柠檬酸 300 mL混合成底物稀释液在100 mL底物稀释液中溶人80 mg的邻苯二胺(OPD)，然后加入80“L的双氧水(H20z)，放5 rain不变色即可使用(使用前配制)。5
