1、ICS 6502030B 41 缮园中华人民共和国国家标准GBT 1 580522008部分代替GBT 158051 1995鱼类检疫方法第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)Quarantine methods of fishPart 2：Infectious haematopoietic necrosis virus(IHNV)200807-3 1发布 20081 1_01实施丰瞀髁鬻瓣警雠瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 舌GBT 15805(鱼类检疫方法分为下列部分：第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)；第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)第3部分：病毒性出血
2、性败血症病毒(VHSV)第4部分：斑点叉尾鲴病毒(CCV)；第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)；第6部分：杀鲑气单胞菌；第7部分：脑粘体虫；GBT 1580522008本部分为GBT 15805的第2部分。本部分代替GBT 158051 1995淡水鱼类检疫方法第一部分中的第4章。本部分与GBT 158051 1995的第4章相比主要变化如下：增加了用PCR方法鉴定IHNV；增加了资料性附录“IHN病毒N基因的全序列(1 176 bp)”；结构格式按GBT 11-2000的规定，作为部分编写。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产
3、标准化技术委员会归口。本部分起草单位：农业部全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 1580511995鱼类检疫方法第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)GBT 15805220081 范围GBT 15805的本部分规定了用逆转录一聚合酶链反应(RTPcR)检测传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的方法。本部分适用于IHNV的分离与鉴定，IHN的流行病学调查、诊断、疫情监测，以及口岸出入境、国内跨区域移动的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 15805的本部
4、分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 6682 1992分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)GBT 18088 2000 出入境动物检疫采样3试剂和材料31 IHNV参考毒株：由农业部指定的动物病原微生物菌(毒)种保藏机构提供。32水：GBT 6682 1992，一级，并要用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，除去DNA和RNA酶。33 Taq酶：-20保存，不要反复冻融或
5、温度剧烈变化。34逆转录酶AMV：一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。35 RNA酶抑制剂(Ranase)：一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。36 dNTP(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmoLL)。37引物：所选取的基因为IHNV的N基因中的片段，两对引物，浓度为40 I-moLL，F1和R1扩增该基因中的786 bp片断，而F2和R2则从786 bp片断中再扩增323 bp片断。上游引物F1：5一TCAAGC-GGG-GAG-TCCTCG-A-3；下游引物R1：5 7一CAc_CGT_ACT_TTpCTpCTA C_3；上游引物F2：5一TTCGCAGAT_C
6、CC-AAC-AAc_AA一3；下游引物R2：5一GC岱CADAG-GCC-TTG-GCT-3。38无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20。39矿物油：分析纯。310溴酚蓝。4仪器和设备41 PCR扩增仪。42电泳仪。43紫外透射仪。44普通冰箱。1GBT 158052200845超低温冰箱。46台式离心机。47电子天平。48低温高速离心机。49微量移液器及吸头。410恒温培养箱。411电动匀浆器。412剪刀，镊子。413离心管和PCR管。414组织研磨器。415倒置显微镜。5 IHNV的分离51采样按GBT 18088-2000的规定执行。对有临床症状的鱼，体长4 cm的鱼苗取整条，若是带卵黄
7、囊的鱼应去掉卵黄囊；体长4 cm6 em的鱼苗取内脏(包括肾)；体长大于6 cm的鱼则取肝、肾、脾。对无症状的鱼取肝、肾、脾；成熟雌鱼还需取卵巢液；鱼卵则取卵壳。52样品处理应在10以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆。再用细胞培养液(见第A1章)按1：10的最终稀释度悬浮。在匀浆前未用抗菌素处理过的样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有抗菌素(1 000 IUmL的青霉素和1 000 ttgmL的链霉素或其他抗菌素)的细胞培养液中，于15下孵育2 h4 h或4下孵育6 h24 h。7 000 rrain离心15rain，收集上清液。卵巢液不必匀浆，稀释两倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的
8、步骤中直接用其上清液。53 IHNV分离对上述l：10的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100和1：1 000Z种稀释度的上清液，以适当体积分别接种到生长约24 h的EPC或者FHM细胞单层中，每孔(2 cm2)的细胞单层最多接种i00 pL稀释液。1518吸附1 h后，加入细胞培养液。置于1518培养。阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7 d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查，接种了被检物匀浆上清稀释液的细胞培养中是否出现细胞病变(CPE)。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7 d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织
9、匀浆上清稀释液的细胞单层培养物。7 000 rmin，4离心15 rain，收集上清液。接种到新鲜细胞单层，培养7 d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。如有CPE出现，则要用PCR方法进行鉴定是否由IHNV引起。如果在阳性对照组也未出现CPE，则试验无效。应采用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病毒学检查。6 IHNV的鉴定61采样对有临床症状的鱼，可以按照51的要求取样直接做RT PCR检测鱼组织中是否有IHNV的核酸。而对无症状的鱼，则应接种细胞，分离到病毒后再用RTPCR鉴定是否存在IHNV。62样品处理如果是
10、鱼样品，取不多于100 mg组织。先加入150 pL CTAB溶液(见第A2章)，用组织研磨器2GBT 1580522008将样品匀浆成糊状，放人15 mL的离心管中，再将CTAB溶液补加至900“l，。如果是有CPE的细胞悬液，则取450 p-I。细胞悬液加人450 p-L CTAB溶液混匀。25作用25 h。63 RNA抽提将处理好的样品离心管中加入600 pL抽提液2(见第A3章)，用力混合不少于30 S。12 000 rmin离心5min，J、心取上层水相(约800 gL)。再加入700止抽提液1(见第A4章)，用力混合不少于30 S。12 000 rrain离心5 rain，小心取上
11、层水相(约600 pL)。再加入一20预冷的15倍体积的无水乙醇约900“L，倒置数次混匀后，-208 h以上沉淀核酸。12 000 rmin离心30min，小心弃去上清液。干燥后加10 pL水溶解后作为RT-PCR模板。64变性和退火在PCR管中加入10 pL模板和25 pL引物R1，加25 pL水使总体积为15 pL。置于70反应5 rain。立即冰浴，低速离心约5 S，将液体收集在底部。65 cDNA合成在上述反应管中继续加入：5 pL的5倍逆转录酶浓缩缓冲液(5buffer)(见第A5章)、2 pLdNTP、05 p-L RNA酶抑制剂(20 u)、1 PL逆转录酶AMV(10 u)和
12、15 pL水，总体积为25 pL。4260 min反应以合成模板的eDNA。66 PCR扩增DNA在上述反应管中再继续加入：10倍Taq酶用浓缩缓冲液8 pL(见第A7章)、25 mmoLL的氯化镁8 p-L(见第A6章)、dNTP 2 pL、引物R1 2 pL和引物F1 2 pL、Taq酶5 u，加水到总体积为100 pL。每管加入50 pL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。在PCR扩增仪中。先94预变性4 min，再941 min一551 min一721 min，30次循环，然后728 rain，最后4保温。67琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液(见第A8章)配制15的琼脂糖(含1 t-
13、gmL EB，见第A9章)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 pL样品和2 pL样品缓冲液(见第A10章)混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子质量作对照，推荐使用pUCl9 DNAMspI(HpalI)。5 Vera电泳约l h，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察有无DNA带并判定结果。68套式PCR如果PCR后的产物在电泳时看不到特异的DNA带，取5 pL产物做模板；如果PCR后的产物在电泳时能看到特异的DNA带则需将产物按1：1001：1 000稀释后，取5 pL做模板。然后依次加入以下试剂：Taq酶5 U，dNTP 2 pL，引物R2 25 pL和引物
14、F2 25 pL，10倍用浓缩的Taq酶缓冲液10 pL，25 mmoLL的氯化镁10 pL，加水到总体积100 pL。每管加入50 pL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94预变性4 rain，再941 min一551 min一721 rain，30次循环，然后728 rain，最后4保温。69设立对照691在61的样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。692取含有已知IHNV参考株的细胞悬液为模板作阳性对照。693取正常的阴性组织为模板作阴性对照。694取等体积的水代替样品为模板作空白对照。7结果判定经第一次PCR后阳性对照会出现一条786
15、 bp的DNA带。阴性对照和空白对照没有该核酸带。套式PCR后阳性对照会出现一条323 bp的DNA带。阴性对照和空白对照均没有该核酸带。待测样品PCR扩增后能在相应786 bp DNA位置上有带，并且套式PCR扩增后能在相应323 bp3GBT 1 580522008位置上有带；或者虽经PCR扩增后可能因浓度太低看不到可见的DNA带，但套式PCR扩增后能在相应323 bp位置上有带者，均可判为阳性。无带的判为阴性。仅在PCR扩增后有786 bp的DNA带，但套式PCR重复两次仍不能扩增出323 bp的DNA带的样品也判为阴性。如果扩增出的DNA带的大小不是786 bp与323 bp应判为阴性
16、。如果带的大小和阳性片段接近难以确定，则需要测序，根据是否和已知DNA片段(参见附录B)的序列吻合来判定。4GBT 1580522008附录A(规范性附录)试剂配制标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A1细胞培养液TCl99培养基，按说明书的要求配制。然后加入10的胎牛血清，抽滤除菌，一20保存。A2 CTAB溶液按cTAB(hexadecyl trimethy ammonium bromide)2，氯化钠14 moLL，EDTA 20 mmoLLTris HCl 20 mmoLL pH一75配制。用前加巯基乙醇至终浓度为025。A3抽提液21 moLL Tris水溶液饱和的酚
17、：三氯甲烷：异戊醇一25：24：1混合，密闭避光保存。A4 抽提液1将三氯甲烷：异戊醇按24：1的比例混合，密闭避光保存。A5逆转录酶AMV的5倍浓缩缓冲液TrisHCl 250 mmoLL，pH 83氯化钾(KCl) 250 mmoLL氯化镁(MgCh)50 mmoLLDTT 50 mmoLLA6氯化镁(MgCl2)溶液浓度为25 mmoLL。A7 Taq酶用10倍浓缩缓冲液TrisHCl 500 mmoLL，pH 88氯化钾(KCI) 500 mmoLLTriton X100 1A8 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris 54 g硼酸(HB03) 275 gEDTA 2922 g水 1
18、000 mL用5 moLL的盐酸(HCI)调到pH 80。A9 EB(ethidium bromide，核酸染色剂)用水配制成10 mgmL的浓缩液。用时每10 mL电泳液或琼脂中加1 pL。A10样品缓冲液每100 mL水溶液中含：溴酚蓝025 g，蔗糖40。GBT 1 580522008附录B(资料性附录)IHN病毒N基因的全序列(1 176 bp)_ _o薯n l atgacaagcg cactcagaga gacgttcact ggactcagag aca熙899爨|：|gggaglCetc61 gaggatccag agacggagta tcgtcccagt acgataaccc t
19、ccctctatt tttctccaag121 acagacttag acctagagat gatcaagcgg gcggtgagtc aagtcggagg agagggaacg181 agaaaggcat tgagcctcct gtgcgcgttc gtcattgcag agacggtccc atcggaggca24 1 ggtacggtcg ccgaacttct ggaagccctg ggtttcgtgc tggagtcttt ggacactggg301 gcaccaccag a。gctacc麟滋i鑫谖蘸ii黼caagc ttgcagaaac gatcgtaaag=一361 gaaaatg
20、tcc ttgaggttgt gaccggcctc ctcttcacct gcgccctact gactaagtat421 gatgtggaca agatggccac atactgccaa aacaagctcg agcgtcttgc aaccagccaa481 gggattggcg agttggttaa cttcaacgcc aacaggggag tcctggccaa gatcggggcg541 gtgcttagac ccggacagaa gctcaccaag gctatctatg ggatcattct catcaacctg=一 ?601 tccgacccag ccatcgctgc cagag
21、ccaag*翟cacigtgcg ccatgagact gagcgggaca661 ggaatgacaa tggtggggct gttcaaccaa721 gaccttttag aggatctgtg catgaagtca78l ctgatgagga tcgtagcaga ggccccaggg841 aggatgctcg gggaggggta cttcaaggcc901 tgcattctca tgaacatcaa cgataggtat961 ataaaggtct ccgacccttt caggaagctg102l aagtacgatg gcgatggctc aaccggagag1081 atgg
22、catctc ggggaccaga catgggtgag1 141 tccagtgagc caggagactc cgactcattc注：涂墨和划线处是引物序列。gccgcaaagagtggtggagtgtagcag鹪atacgggatcagacgatg998gcgagggagaggggcgtcaggaggaggaggcactgaacctgggcgcccgccagacgagjacggtgtacgagaacgccctcgagaggtcgctcgtctagctgatccgaggacgaggaccttccagcccattgtcagacatgatgagccaggatcaccactgacagggccttglcctcccgggcggagggacgacgac
