1、ICS 6502030B 41 a亘中华人民共和国国家标准GBT 1 580542008部分代替GBT 158051一1995鱼类检疫方法第4部分：斑点叉尾鲴病毒(CCV)2008073 1发布Quarantine methods of fishPart 4：Channel catfish virus(CCV)20081卜01实施宰瞀嬲鬻瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会“1”刖 昌GBT 15805(鱼类检疫方法分为下列部分：第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)；第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)；第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)第4部分：斑点叉尾鲴病毒(CCV
2、)；第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)；第6部分：杀鲑气单胞菌；第7部分：脑粘体虫；GBT 1580542008本部分为GBT 15805的第4部分。本部分代替GBT 1580511995淡水鱼类检疫方法第一部分中的第6章。本部分与GBT 158051 1995的第6章相比主要变化如下：增加了用PCR方法鉴定CCV；增加了资料性附录。CCV的PCR产物序列”；结构格式按GBT 112000的规定，作为部分编写。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分起草单位：农业部全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳
3、出入境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 158051 1995。鱼类检疫方法第4部分：斑点叉尾鲴病毒(ccv)GBT 15805420081范围GBT 15805的本部分规定了用中和试验和PCR技术检测斑点叉尾鲴病毒(CCV)的方法。本部分适用于CCV的分离与鉴定，斑点叉尾鲴病毒病的流行病学调查、诊断、监测以及口岸出入境、国内跨区域移动的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，
4、然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)GBT 18088-2000出人境动物检疫采样3试剂和材料31水：GBT 6682 1992，一级。32 CCV毒株和CCV的DNA：由农业部指定的动物病原微生物菌(毒)种保藏机构提供。33阴性对照：正常细胞组织悬液。34 CCV参考抗血清。35 Taq酶：一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。36 dNTP(含dcTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmoLL)。37引物：使用时
5、浓度为40 pmoLL。其序列如下：上游引物：5 7一TCA-TCC-GAA-Tcc_GAC-AAoTGA-3；下游引物：5f_CCA-AGA-TCG-CGG-AGmAAc_3。扩增目的基因中的136 bp片段。38无水乙醇：分析纯，使用前预冷到-20。39矿物油：要求无DNA酶和RNA酶。310 DNA分子质量标准(Marker)。4器材和设备41 96孔细胞培养板。42微量移液器及吸头。43倒置显微镜。44恒温培养箱。45普通冰箱和低温冰箱。46组织研磨器。47离心机和离心管。1GBT 158054200848 PCR扩增仪。49电泳仪。410紫外观察灯。4”剪刀、镊子。5 CCV的分离5
6、1采样按GBT 18088-2000的规定采样。对有临床症状的鱼，体长4 cm的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊。体长4 cm6 cm的鱼苗取内脏(包括肾)；体长大于6 Em的鱼则取肝、肾、脾。对无症状的鱼取肝、肾、脾；成熟雌鱼还需取卵巢液。鱼卵则取卵壳。52样品处理应在10以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆。再用细胞培养液(见第A1章)按1：10的最终稀释度悬浮。在匀浆前未用抗菌素处理过的样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有抗菌素(1 000 IUmL的青霉素和1 000 pgmL的链霉素或其他抗菌素)的细胞培养液中，于15下孵育2 h4 h或4下孵育6 h24 h。7 000 rmi
7、n离心15 rain，收集上清液。卵巢液不必匀浆，但须稀释两倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。53病毒分离对上述1：10的组织匀浆上清液用细胞培养液再作两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100和1：1 000=种稀释度的上清液，以适当体积分别接种到生长约24 h的CCO(斑点叉尾鲴卵巢细胞)细胞单层，每孔(2 cm2)的细胞单层最多接种50 pL稀释液。2530吸附l h后，加入细胞培养液。置于2530培养。阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7 d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查，接种了被检物匀浆上清稀释液的细胞培养中是否出现细胞病变(CPE)。空白对
8、照细胞应当正常。如果阳性对照细胞出现CPE，而待测样品接种的细胞没有CPE出现，则在培养7 d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释渡的细胞单层培养物。7 000 rrain，4离心15 rain，收集上清液。接种到新鲜细胞单层，培养7 d。每天用40倍到100倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。如有CPE出现，则要用中和试验或PCR方法鉴定是否由CCv引起。如果在阳性对照组也未出现CPE，则试验无效。应采用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病毒学检查。6病毒的鉴定I：中和试验61试验准备611 CCO细胞
9、培养于96孔微量细胞培养板上，24 h内长成单层。612 CCV毒株，传代后制成病毒悬液。613抗CCV的参考血清，使用前于56灭活60 min。614待检样品(出现了CPE的细胞培养物)：冻融一次，除去细胞碎片后使用。62操作步骤621将待检样品用细胞培养液作系列稀释，使其稀释度由lo。到10，每管体积为05 mL。622取两排试管，分别从上述各稀释度的待检样品中取出02 mL于两排试管中，然后第一排管加入02mL抗CCV参考血清，第二排管加入02mL细胞培养液，充分混合均匀。623 25温育60min。624温育后分别将第一排管与第二排管的样品接种于已长满细胞单层的96孔微量细胞培养板，每
10、2GBT 1580542008个稀释度4孔，每孔01 mL。625将抗CCV参考血清倍比稀释后(1：8至l：64)接种于上述培养板，每个稀释度2孔，每孔005 mL，作为参考血清对照。626将CCV参考病毒按照621623的方法由10_1到10“稀释，并和参考血清混合反应后加入细胞板，每个稀释度2孔，每孔01 mL，作为“参考病毒+参考血清”对照，细胞板中剩余8孔中4孔作正常细胞对照，4孔接参考病毒原液傲病毒对照。627各孔再加入细胞培养液01 mL。628放入2530培养箱中培养，逐日观察细胞病理变化，并按表l记录试验结果。表1 中和试验结果记录表待检样品+参考血清 待检样品+细胞培养液参考
11、病毒+ 参考项 目 参考血清 血清对照1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 10-1 18B 102 1：8 细胞C 103 1：16 对照D 10- 1：16E 10一5 1 2 3ZF 10一5 1 2 32 病毒G 107 1：64 对照H 10-8 1：6463结果计算按Reed-Muench法分别计算出“待检样品+参考血清”以及“待检样品+细胞培养液”的细胞半数感染量(TCIDso)，二者的滴度指数之差的反对数即为中和指数。若正常细胞与参考血清对照为阴性，标准毒对照为阳性，按表2判定结果。襄2中和试验结果判定表中和指数 结果判定50 阳性7病毒鉴定：聚合酶链式反应(
12、PCR方法)71样品处理将450 pL有病变的细胞悬液放人15 mL的离心管，再加入450 pL CTAB溶液(见第A2章)并混匀。25作用2 h。72 DNA抽提在含有样品的塑料离心管中加人600止抽提液2(见第A 3章)，用力混合至少30 s。12 000 rmin离心5min，小心取上层水相(约800 pL)。再加入700 pL抽提液1(见第A4章)，用力混合至少30 s。12 000 rmin离心5 rain，小心取上层水相(约600 pL)。再加入-20预冷的15倍体积的无水乙醇(约900 pL)，倒置数次混匀后，一208 h以上沉淀核酸。lz 000 rrain离心30 rain，
13、小心弃去上清液。干燥后加10 pL水溶解，用作PCR模板。3GBT 158054200873 PCR依次加入以下试剂：模板10 pL，10倍用浓缩的Taq酶缓冲液10吐(见第A5章)，25 mmoLL的氯化镁(MgCl2)(见第A6章)10 pL，Taq酶5U，dNTP 2 pL，引物各25 pL，加水到总体积为100 pL。每管加入50 pL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先944 rain预变性，再941 min一601 rain一721 rain，30次循环，然后7z8 mirt，最后4保温。74对照的设立741在71的样品处理过程中应设立阳性对照、
14、阴性对照和空白对照。742取含有已知CCV病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。743取正常的细胞悬液作为阴性对照。744取等体积的水代替模板作为空白对照。75琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液(见第A7章)配制2的琼脂糖(含l-gmL EB，见第A8章)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 PL样品和2 pL样品缓冲液(见第A9章)混匀后加人样品孔。在电泳时设立DNA标准分子质量作对照，推荐使用pUCl9 DNAMsp I(Hpa)。5 Vcm电泳约05 h，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。76结果判定含有CCV的阳性对照在PCR以后应出现136 bp的D
15、NA带。而阴性对照和空白对照不应有这个DNA带。如果待测样品中看不到136 bp的带为阴性，能看到136 bp的带为阳性。如果阳性对照中什么带都看不到，说明PCR反应没有发生。如果阴性样品中有136 bp的带，说明试验中有污染需要重做。如果待测样品产生的DNA带大小异常或者无法准确判定大小，需要重新做并将片段进行基因测序，然后与已知标准基因序列比较(参见附录B)。8综合判定81若出现临床症状，经细胞培养又出现CPE，并经中和试验或者PCR试验为阳性者可判定患有斑点叉尾鲴病毒病。82经细胞培养出现CPE，并经中和试验或者ELISA检测为阳性者，若出现临床症状，可判定患有斑点叉尾鲴病毒病；若无临床
16、症状，判定为CCV携带者。83若分离到病毒后，仅中和试验为可疑，PCR试验为阴性，则判定为可疑。附录A(规范性附录)试剂配制GBT 1580542008标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A1细胞培养液：199培养基，按说明书的要求配制。然后加入10的胎牛血清，抽滤除菌，-20保存。A2 CTAB溶液按CTAB(hexadecyl trimethy ammonium bromide)2，氯化钠(NaCl)14 molL，EDTA20 mmolL，TrisHCl 20 mmolL pH=75配制。用前加巯基乙醇至终浓度为025。A3抽提液21 molL Tris水溶液饱和的酚：三
17、氯甲烷：异戊醇一25：24：1混合，密闭避光保存。A4抽提液1将三氯甲烷：异戊醇按24：1的比例混合，密闭避光保存。A5 Taq酶用10倍浓缩缓冲液TrisHCI 500 mmolL，pH 88氯化钾(KCI) 500 mmolLTriton X-100 1A6氯化镁(MgClz)溶液浓度为25 mmolL。A7 TIlE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris 54 g硼酸(HB03) 275 gEDTA 2922 g水 1 000 mL用5 molL的盐酸(HCl)调到pH 80。A8 EB(ethidium bromide，核酸染色剂)用水配制成10 mgmL的浓缩液。用时每10 mL电泳液或琼脂中加1 pL。A9样品缓冲液每100mL水溶液中含：溴酚蓝025 g，蔗糖40 g。CBT 1580542008附录B(资料性附录)CCV的PCR产物序列签遴鬻笺邈透固筮篓鹱透鬯l萋l篓CGCGTc_GGT-AGc CCCrACC GAT CCCrTAT GTTACC-GGT-GCC-GGpGTC-GAC ACC-GTG-CTC GCC-GCC-ATG-AG(CTC-ACC GCG-GACACC-GGG-GGT CCCCCT C筮遴慈鍪遴塑篓鍪隧筮K注；涂墨和下射线处是引物序列。6
