1、lCS 6502030B 41 a园中华人民共和国国家标准GBT 1 580552008部分代替GBT 158051 1995鱼类检疫方法第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)200807-3 1发布Quarantine methods of fishPart 5：Spring viraemia of carp virus(SVCV)20081卜01实施宰瞀髁鬻黼警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 吾GBT 15805鱼类检疫方法分为下列部分：第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)；第2部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)第4部分：斑
2、点叉尾鲴病毒(CCV)；第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)；第6部分：杀鲑气单胞菌；第7部分：脑粘体虫；GBT 1580552008本部分为GBT 15805的第5部分。本部分代替GBT 158051 1995淡水鱼类检疫方法第一部分中的第7章。本部分与GBT 158051 1995的第7章相比主要变化如下：_-_删除了临床检查；改用PCR方法代替中和试验鉴定SVCV；增加资料性附录B“SVC病毒G基因的全序列(1588 bp)”；结构格式按GBT 11 2000的规定，作为部分编写。本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技
3、术委员会归口。本部分起草单位：农业部全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 1580511995。鱼类检疫方法第5部分：鲤春病毒血症病毒(svcv)GBT 15805520081范围GBT 15805的本部分规定了细胞分离病毒后，用RTPCR技术检测SVCV的方法。本部分适用于SVCV的分离和鉴定，SVC的流行病学调查、诊断，以及口岸出入境、国内跨区域移动的检疫。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随
4、后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 6682 1992分析实验室用水规格和试验方法(neq IsO 3696：1987)GBT 18088-2000出入境动物检疫采样3试剂和材料31 水：GBT 6682 1992，一级。用于RTPCR(包括核酸抽提)时所用的水要用焦碳酸二乙脂(DEPC)处理以除掉RNA酶。3。2 SVCV参考株：由农业部指定的动物病原微生物菌(毒)种保藏机构提供。33 Taq酶：一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。34逆转录
5、酶AMV：10 UmL。一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。35 RNA抑制剂(RNasin)：40 upL。一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。36 dNTP(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmolL)。37引物：该试验选用SVCV的糖蛋白基因作为PCR的模板。该基因长1 588 bp，在这里用了两对引物：F1和R2扩增该基因中的714 bp片断，而F1和R4则从该片断中再扩增606 bp片断。所以实际上是“半套式”的PCR(seminested PCR)。使用时浓度为40 vmolL。其序列如下：R2： 5一AGA TGG TAT GGA CCC CAA TAC
6、ATH ACN CAY一3。R4： 5一CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY TGY一3。F1： 5一TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR RTC-3。38无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20。39矿物油：要求无DNA酶和RNA酶。310 DNA分子质量标准(Marker)。4器材和设备41 96孔细胞培养板。42倒置显微镜。43恒温培养箱。44普通冰箱和低温冰箱。1GBT 158055200845组织研磨器。46离心机和离心管。47 PCR扩增仪。48电泳仪。49微量移液器及吸头。410紫外观察灯。5 SVCV的分离51采样按GBT 18088 2000的
7、规定执行。对有临床症状的鱼，如是体长4 cm的鱼苗取整条鱼；体长4 cra6 cm的鱼苗取内脏(包括肾)；体长大于6 cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、脾、鳃和脑组织；成熟雌鱼还需取卵巢液。52样品处理应在lo以下。先用组织研磨器将样品匀浆成糊状。再按1：10的最终稀释度重悬于细胞培养液(见第A10章)中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有l ooo 1umL青霉素和1 000,gmL链霉素的细胞培养液中，于15下孵育2 h4 h或4下孵育6 h24 h。7 000 rmin离心15 rain，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染。不
8、必匀浆但需稀释两倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。53病毒分离对1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1：10、1：100和1：1 000三个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24 h的CO、EPC或者FHM细胞单层中，每孔(2 cm2)的细胞单层最多接种100 pL稀释液。1520吸附05 h1 h后，加入细胞培养液。置于1520培养。试验中要有2孔阳性对照(接种SVCV参考株)和空白对照(未接种病毒的细胞)。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7 d内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查，接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中是否出现细胞病变(
9、cPE)。空白对照细胞应当正常。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7 d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7 000 rmin，4离心15 min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7 d。每天用40倍到00倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。如有CPE出现，则要用RT-PCR方法进行鉴定是否由SVCV引起。如果阳性对照也未出现CPE，则试验无效。应采用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方法进行病毒学检查。6 SVCV的鉴定61样品处理将450 pL细胞病变悬液放入1
10、5 mL的离心管，再加入450 tzL CTAB溶液(见第A1章)并混匀。25作用2 h。62 RNA抽提在含有样品的塑料离心管中加入600 pL抽提液2(见第A3章)，用力混合至少30 S。12 000 rmin离心5 min，小心取上层水相(约800 lzL)。再加入700 pL抽提液1(见第A2章)，用力混合至少30 S。12 000 rmin离心5 min，小心取上层水相(约600 pL)。再加入一20预冷的15倍体积的无水乙醇(约900 pL)，倒置数次混匀后，一208 h以上沉淀核酸。12 000 rrain离心30 min，小心弃去上清液。干燥后加10 pL水溶解，作为PCR模板
11、。63变性和退火在PCR管中加入10 pL模板和25 pL引物R2，加25 pL水使总体积为15 pL。置于70反应2GBT 15805520085 rain。立即冰浴，低速离心约5 s，使液体集中在底部。64 cDNA合成在上述反应管中继续加入：5 gL的5倍逆转录酶浓缩缓冲液(见第A5章)、2”L dNTP、05LLRNA酶抑制剂(20 u)、1 pL逆转录酶AMV(10 u)和15 pL水。总体积为25“L，4260 min反应以合成模板的cDNA。65 PCR扩增DNA在上述反应管中再继续加入：10倍Taq酶用浓缩缓冲液(见第A7章)8 pL、25 mmolL的氯化镁(MgCl2)(见
12、第A6章)8 pL、dNTP 2弘L、引物R2 2弘L和引物F1 2 pL、Taq酶5 u、加水到总体积为100”L。每管如入50 pL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94预变性，再941 min一501 min一721 min，30次循环，然后728 min，最后4保温。66琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液(见第A4章)配制2的琼脂糖(含1 pgmL EB，见第A8章)平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 pL样品和2 pL样品缓冲液(见第A9章)混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，推荐使用putl9 DNAMspI
13、(Hpaid。5 Vcm电泳约05 h，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。67套式PCR如果PCR后产物电泳时看不到DNA带，取5 pL产物做模板；如果PCR后产物电泳时能看到DNA带，只是要求进一步核实，则需将产物按1：1 000稀释后，取5 pL做模板。然后依次加入以下试剂：Taq酶5 U，dNTP 2 pL，引物R4 25 pL和引物Fl 25 pL，Taq酶用10倍浓缩的缓冲液10 pL，25 mmolL的氯化镁(MgCl2)10 pL、加水到总体积为100 pL。每管加入50 pL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先预变性，再
14、941 min一50 12 1 min一72 12 1 rain，30次循环，然后728 rain，最后4保温。68对照的设立681在61的样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。682取含有已知sVCV参考株的细胞悬液作为阳性对照。683取正常的细胞悬液作为阴性对照。684取等体积的水代替模板作为空白对照。7结果判定样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判为阴性。有CPE出现，则要用RT-PCR方法进行鉴定是否由SVCV引起。PCR后阳性对照会出现一条714 bp的DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。套式PCR后阳性对照会出现一条606 bp的DNA片段。阴性对照
15、和空白对照均没有该核酸带。待测样品PCR扩增后能在相应714 bp DNA位置上有带，并且套式PCR扩增后能在相应606 bp位置上有带；或者虽经PCR扩增后可能因浓度太低看不到可见的DNA带，但套式PCR扩增后能在相应606 bp位置上有带者，均可判为阳性。无带的判为阴性。仅在PCR扩增后有714 bp的DNA带，但套式PCR重复两次仍不能扩增出606 bp的DNA带的样品也判为阴性。如果扩增出的DNA带的大小不是714 bp与606 bp应判为阴性。如果带的大小和阳性片段接近难以确定，则需要测序，根据是否和已知DNA片段的序列吻合来判定。3GBT 1580552008附录A(规范性附录)试
16、剂配制标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A1 CTAB溶液按CTAB(hexadeeyl trimethy ammonium bromide)2，氯化钠(NaCI)14 molL，EDTA 20 mmolLTrisHCl 20 mmolL pH=75配制。用前加巯基乙醇至终浓度为025。A2抽提液1将三氯甲烷：异戊醇按24：l的比例混合，密闭避光保存。A3抽提液21 molL Tris水溶液饱和的酚：三氯甲烷：异戊醇=25：24：l混合，密闭避光保存。A4 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)Tris 54 g硼酸(HBOs) 275 gEDTA 2922 g水 1 000 mL用
17、5 molL的盐酸(HCI)调到pFl 80A5逆转录酶AMV的5倍浓缩缓冲液TrisHCl氯化钾(KCI)氯化镁(MgClz)DTT250 mmolL，pH 83250 mmolL50 mmolL50 mmolLA6氯化镁(MgCl2)溶液浓度为25 mmolL。A7 Taq酶用10倍浓缩缓冲液TrisHCl 500 mmolL，pH 88氯化钾(KCl) 500 mmolLTriton X-100 1A8 EB(ethidium bromide，核酸染色剂)用水配制成i0 mgmL的浓缩液。用时每10 mL电泳液或琼脂中加1 pL。A9样品缓冲液每100 mL水溶液中含：溴酚蓝025 g，
18、蔗糖40 g。A10细胞培养液TCl99培养基，按说明书的要求配制。然后加入10的胎牛血清，抽滤除菌，一20保存。4附录B(资料性附录)SVC病毒G基因全序列(1 588 bp)GBT 1 580552008l aacagacatc atgtctatca tcagctacat cgcattcctt ttgctaattg actccaactt61 aggaatcccc atatttgttc catctggtcg aaatatatca tggcagcctg tgattcagccl 21 atttgattat caatgtccaa tccatggaaa cctacccaac acgatgggtt t
19、gagtgccac1 81 caaattgaca ataaaatctc catctgtatt cagtacagat aaagtgtctg gatggatctg241 ccatgcagct gaatggaaaa caacttgtga ttatagatggi，a，t，gg。$。c。c。c。c。a。a。f。a。画tcac301 ccacagtatt catccgatca gtcctaccat agatgaatgc aggagaatca ttcaaaggat361 tgcatcaggg actgatgaag at壁!丝堡，!熊!塑鳞。鲨鳖!ggat gggcatctgt42l cacaacggtg t
20、caaatacta attatagagt agtaccccat tctgttcatt tagagccata481 cggaggacat tggatcgatc acgaatttaa tgggggcgaa tgcagagaaa aagtgtgcga5t 1 aatgaaaggg aatcactcta tttggatcac agaggagact gtacagcatg agtgtgcaaa60l acatatagag gaagttgaag gaattatgta cgggaatgtt ccaagagggg atgtaatgta66l tgctaacaac tttattatag atagacatca ca
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23、t atccctttga atatgataga atcaggaatc atagatgatg agcttcaaca1261 tgctttccaa gccgatatta tccctcatcc tcattatgat gacgatgaaa tccgagagga132l tgatatattt ttcgataaca ctggagaaaa tggaaatcct gtagatgcag tggtagaatgl 381 ggttagtgga tggggaacta gtctaaagtt ctttggcatg actctggtcg ccctgatcctt441 gatctttctt ctcatcagat gctgtgttgc ttgcacttat ttgatgaaga ggagtaaact1501 gcctgcaaca gaatcacacg aaatgcggtc tttagtttga gagacagcag attaccaaga1561 tattatctca atagatgtat gaaaaaaa注：涂墨和划线处为引物序列。5
