1、中华人民共和国国家标准船舶散装运输液体化学品危害性评价规范哺乳动物毒性试验方法发布实施国家技术监督局发布前言船舶散装液体危害性评价规范系根据附则的要求为船舶散装运输的液体化学品的污染分类而进行的污染危害性评价和污染分类的方法其危害评价和分类的原则和内容系根据附则中有害液体物质分类准则附则之附录以及海洋污染科学专家组关于船运有害物质危害性评价的原则确定评价内容包括水生生物积累试验水生生物沾染试验水生生物急性毒性试验哺乳动物毒性试验即本标准休息环境舒适性影响分类程序和方法鉴于导则中危害性经口急性毒性及皮肤接触和吸入毒性均为哺乳动物试验内容故合为一个分标准另外环境舒适性的评价系根据物质对人的毒性刺激
2、性以及由其理化特性决定的对环境影响的持久性等综合评价无具体试验方法所以不单列分标准而并入评价程序和分类中本标准由中华人民共和国交通部提出本标准起草单位交通部水运科学研究所负责起草本标准起草人王洁云张秀芝张宝东赵前中华人民共和国国家标准船舶散装运输液体化学品危害性评价规范哺乳动物毒性试验方法国家技术监督局批准实施范围本标准规定了哺乳动物急性毒性和毒理学试验方法本标准适用于船舶散装运输液体化学品以下均称化学品的危害性评价和污染分类引用标准下列标准所包含的条文通过在本标准中引用而构成为本标准的条文本标准出版时所示版本均为有效所有标准都会被修订使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性化妆品安
3、全性评价程序和方法卫监发第号农药安全性毒理学评价程序控制散装有毒液体物质污染规则定义本标准采用下列定义液体化学品系指那些在温度为时蒸汽压力不超过的物质试验方法急性经口毒性试验目的求出试验化学品对试验动物的半致死剂量初步估计该化学品对人类的危害为毒性分级和制定安全防护措施提供依据通过观察急性毒效应的症状初步了解动物中毒表现和毒作用的靶器官为亚慢性与慢性试验提供剂量水平设计的依据试样化学品原液试验动物选用品系遗传背景明确的初成年大鼠和小鼠大鼠体重小鼠体重同一次试验中同性别动物体重波动范围小于每一剂量组大鼠不少于只雌雄各半小鼠雌雄各只为宜试验前动物应检疫观察天确认健康方可使用剂量分组至少设个剂量组各
4、剂量组之间要有适当的间距以便各组出现不同程度的毒性反应或死亡率求得剂量反应曲线及如染毒剂量达以上动物仍不出现死亡则不需要进行更高剂量组的试验染毒方法及观察时间染毒前隔夜禁食不禁水通过胃管一次性或在内多次投毒投毒后继续禁食投毒后观察并记录动物的中毒表现出现症状和死亡时间一般观察期为天观察指标仔细观察中毒表现的发生发展过程和规律观察内容包括体位异常痉挛抽搐麻痹运动失调对外反应过敏或迟钝瞳孔散大或缩小流涎或流泪紫绀背毛蓬松眼球突出等投毒前死亡时各测一次体重对染毒期间死亡的动物进行肉眼尸检若有可见病变时进行镜检以获取有用的资料数据处理用任何一种公认的统计方法计算急性经皮毒性试验目的了解化学品对皮肤直接
5、接触能否引起局部皮肤损伤全身中毒致死剂量中毒特征等毒性反应为毒性分级和制定防护措施提供依据试样化学品原液或制剂试验动物大鼠兔豚鼠任选一种为有足够的涂敷面积选成年动物大鼠体重兔豚鼠剂量分组设个剂量组各剂量组间应有一定的间距以便染毒组能出现毒性表现和死亡如果染毒剂量大于仍不出现死亡则不需要进行更高的剂量试验染毒方法染毒前将动物腹部或背部剃毛注意勿损伤皮肤剃毛面积应占体表面积的染毒部位应在大鼠背部中央或腹部兔通常在背部中线两侧先将动物固定在略小于剃毛区面积内进行定量敷毒然后覆盖一个与剃毛面积相当的盒式罩再用胶布固定根据需要染毒时间可为为防止动物舔食受试化学品可使用限制动物活动的制动器染毒后取下罩盒擦
6、去皮肤上的受试物用清水清洗但要特别小心避免损伤皮肤或毒物扩散到皮毛中观察中毒表现观察指标观察并记录中毒表现死亡时间及死亡率数据处理用任何一种公认的统计方法计算急性吸入毒性试验目的测试可能经呼吸道进入机体的化学品对呼吸道及全身的损伤及其危害程度求出吸入接触的致死浓度为化学品毒性分级和制定安全防护措施提供依据试样化学品原液试验动物一种以上哺乳动物首选大鼠动物性别体重每组数量同剂量分组设计应有毒性反应直至死亡的几个间距染毒组一般为组以便各组产生不同程度的中毒反应或死亡率求出半致死浓度如果浓度超过染毒仍无死亡则无需再做高浓度试验染毒方法及观察时间染毒方式为鼻头部接触或全身置于染毒柜内接触染毒柜大小以染
7、毒部位总体积不超过染毒柜的为宜染毒方式分为静式和动式染毒时间为染毒后观察并记录动物的中毒表现及死亡时间观察周期一般为天试验项目同数据处理用任何一种公认的方法计算急性皮肤刺激试验目的测定化学品对哺乳动物皮肤是否有刺激或腐蚀作用估计人体接触该化学物质时可能出现的危害试样化学品原液试验动物多种哺乳动物首选白色家兔每个染毒组至少只健康家兔剂量分组受试化学品或为一次药量动物自身皮肤作为对照如果受试化学品或则不必进行皮肤刺激试验试验步骤试验前将背部毛剪掉面积为涂上受试化学品再用纱布盖上以胶布固定或采用其他封闭性盖罩涂敷时间一般为试验结束时用水洗去残留的化学品但注意不要损伤皮肤去掉受试液体化学品后检查动物局
8、部皮肤有无红斑或水肿并按表划分反应的等级表皮肤反应分级红斑和焦痂级无红斑级很轻的红斑勉强看到级明显红斑级中等红斑级严重红斑紫红到轻度焦痂形成深部损伤水肿级无水肿级很轻的水肿勉强看到级轻度水肿隆起而轮廓清楚级中度水肿隆起近级严重水肿隆起超过并超出敷药面积根据需要做进一步的观察以确定反应的可逆性一般观察期不超过天把动物试验结果外推到人要慎重考虑在很多情况下人对刺激物质比动物要敏感些急性眼粘膜刺激试验目的测定化学品对哺乳动物眼粘膜是否有刺激初步估计对人体健康的影响试样化学品原液试验动物幼龄成熟白色家兔至少只试验前检查受试家兔双眼有异常者不得使用剂量受试液体化学品一般为固体糊状或颗粒状受试物不超过或对
9、具有强酸强碱性质的化学品如或不需做此试验染毒方法及观察时间将一侧下眼睑轻轻拉下把受试化学品滴入结膜囊内为防止该化学品外溢立即轻轻闭合眼睑约如用喷雾染毒法将眼睑分开在眼前方距离处迅速喷雾给药后内不洗眼另一侧眼为对照不另设对照组给药后分别检查眼睛如仍无刺激反应终止试验如果出现角膜损伤或眼睛其他部位出现反应需继续观察损伤的经过及其可逆性观察期最长不超过天染毒后刺激反应仍不消退时至少另选只家兔观察洗眼效果即滴入受试化学品后分别在进行洗眼观察洗眼后的眼睛反应情况观察指标除了观察角膜虹膜外还应注意其他部位的损害按表眼睛损害分级详细记录表眼睛损害分级角膜级无溃疡或混浊级散在或弥漫性混浊级半透明区容易分辨虹膜
10、模糊不清级出现灰白色半透明区看不到虹膜细节瞳孔大小勉强看清级角膜不透明或穿孔虹膜级正常级瞳孔对光反应迟钝级瞳孔对光无反应虹膜出血有肉眼可见的破坏结膜级血管正常级睑结膜球结膜角膜和虹膜充血级散在的深红色各个血管不易分辨级散在的紫红色结膜水肿级无水肿级轻度水肿级明显水肿并有部分眼睑外翻级水肿使眼睑接近半闭合级水肿使眼睑超过半闭合眼睛的刺激等级须与刺激的性质可逆程度或观察到的其他反应联系起来进行评价皮肤致敏试验目的测定受试化学品诱发皮肤致敏反应的可能性推测对反复接触该化学品的人群可能存在的危险试样化学品原液试验动物豚鼠所用动物的数量和性别取决于该化学品的使用方法剂量致敏诱导剂量允许引起皮肤轻度刺激反
11、应激发剂量低于致敏剂量不引起原发刺激性皮肤炎症反应以预备试验结果确定采用动物自身对照试验方法在豚鼠背部正中线两侧各去毛一块涂药另一块作为对照或后用清水或酒精轻轻拭去对照区也同样擦拭进行对比观察每日观察局部反应连续日并做详细记录第日起相继重复一或二次如不出现过敏反应则认为该化学品不引起过敏反应试验项目与基本相同如皮温皮色水肿红斑干燥溃疡或结痂以及恢复情况等迟发性神经毒性试验目的迟发性神经毒性是指能引起迟发性的迁延性运动共济失调通过本试验可估计和评价受试化学品的迟发性神经毒性有机磷酸酯类化合物和某些具有有机磷酸酯剂结构特点的化合物应进行本试验试样化学品原液试验动物选用常规试验动物选用健康步态正常的
12、来亨母鸡鸡龄个月体重每剂量组母鸡数量应保证试验结束时至少存活只到期处死如需观察恢复情况则应在开始实验时增加延长观察期的动物数染毒方法一般设三个染毒剂量组一个阳性对照组和一个空白对照组高剂量组根据或预试验确定一般受试物的剂量应接近致死剂量低剂量组一般为高剂量的中剂量组剂量在高低之间阳性对照组三邻甲苯磷酸酯空白对照除不接触受试化学品外其他各种条件与试验组相同一般采用隔夜禁食经口给药给药前内所有受试母鸡均予肌肉注射硫酸阿托品试验期限观察期一般为天如未见异常反应或有可疑反应时须再次染毒继续观察天每天观察母鸡有无行为异常运动性共济失调和瘫痪等发生到期处死母鸡作病理组织学检查临床观察和检查投毒后每天观察记
13、录染毒鸡的外观体征行为活动特别是鸡的站立和运动姿势以及运动失调程度必要时可强迫母鸡活动如爬楼梯等以便观察迟发性神经毒性的最小反应其典型症状分级标准如表一般迟缓性神经毒性在第第天开始出现并逐渐加重表迟缓性神经毒性分级标准步态稍异常步态严重异常勉强站立躺倒在地每周称体重一次对试验期结束后死亡或存活动物作延髓桥脑大脑皮质小脑脊髓包括上位颈段胸位中段腰骶结合部和坐骨神经等作组织切片坐骨神经切片要作髓鞘和轴索的特殊染色染色光镜检查亦可作电镜观察结果评价试验结果要结合所观察的神经毒性反应和神经组织学检查结果进行综合考虑特别要注意不同受试物剂量下神经毒性反应的有无发生率和严重程度的关系致突变试验目的检测受试
14、化学品的诱变性是否具有致癌作用的可能性原理致突变是指化学诱变源损伤生物的遗传物质导致不可逆的损伤这种诱变如发生在体细胞则影响个体本身如发生在生殖细胞则可遗传到后代试样化学品原液试验方法按农药安全性毒理学评价程序试验哺乳动物骨髓细胞微核试验大鼠或小鼠骨髓细胞染色体畸变试验生殖细胞染色体畸变试验显性致死试验精子畸变试验上述种致突变短测试验方法中试验为首选其次为微核骨髓细胞生殖细胞染色体畸变试验其他试验可作为补充评价致突变试验的任何阳性结果均表示该受试化学品是一种潜在的致突变物同时也一定要认识到目前所用的方法并不能测出所有具有致突变作用的化学品因此所得的阴性结果并不能作为完全无遗传毒性的依据致畸试验
15、目的测定受试液体化学品能否在胚胎发育时期引起永久性的结构和机能的改变试样化学品原液试验动物大鼠兔和小鼠推荐使用大鼠和兔每个剂量组需要只妊娠的大鼠或小鼠只妊娠兔确保有足够数量的仔畜以便评价受试化学品的致畸作用剂量至少选三个按几何级数增加的剂量最高剂量为能产生约死亡率的最大容许剂量最低剂量是胎儿不产生显著毒性反应的剂量中间剂量有助于评价观察到的剂量反应关系为准确估计这三个剂量有必要在胎儿器官形成期用几种不同的剂量进行一次预试验如果剂量大于时对受试动物仍不产生明显的毒性作用或致畸作用可不设其他剂量组继续试验试验方法按农药安全性毒理学评价程序评价致畸试验结果应根据观察到的反应和引起反应的剂量进行评价需
16、要考虑该试验所用的动物品种品系的历史性致畸数据典型的畸形是显而易见的如兔唇泌尿系统发育不全畸形足等各种情况都有可能发生而且某一受试化学品的效应有时仅仅是增加正常情况下的畸胎发生率最后的评价有赖于所得结果的统计分析生殖毒性试验目的评价受试液体化学品对动物生育能力妊娠及后代的影响提供母体和后代繁殖能力和妊娠的资料受试液体化学品的影响可通过几代繁殖的表现加以确定原理生殖毒性试验分三个阶段第一阶段为受试化学品对父体母体生育能力的影响这些影响可能是性腺功能青春期交配行为受孕率的改变等第二阶段为胎儿的发育及正常程度畸变和突变反应以及死胎的比率第三阶段为母体的反应例如哺乳及后代接受情况这与后代的成长及性功能
17、的成熟有关试验方法按农药安全性毒理学评价程序评价根据临床所见的行为改变脏器重量肿瘤和其他损伤死产及肉眼和病理组织学检查来评价所得的结果为保证评价结果的准确对得到的数据要进行严格的统计分析亚慢性毒性试验目的观察反复接受受试化学品可能对机体的毒性作用和靶器官的影响同时提出无作用剂量该值可作为慢性毒性试验的剂量并为确定人的安全剂量提供依据试样化学品原液试验动物用断乳后年幼健康的动物首选大鼠也可用狗或灵长类动物每一剂量组大鼠至少只雌雄各半狗至少只雌雄各半试验结束时的动物数应足以对毒性反应作出有意义的评价剂量至少有三个剂量组和一个对照组剂量组应包括足以产生毒性反应但不会致命的高剂量组低剂量组为确定无效应剂量中剂量组用以确定前二者的正确性染毒期限为天染毒途径根据试验目的要求以及可能与人接触的方式选择吸入经皮灌胃或饲养等染毒方式试验项目血液学检查包括红细胞数血红蛋白含量白细胞数及其分类血小板数等血液生化检查包括血清谷丙转氨酶血清谷草转氨酶鸟氨酸脱羧酶尿素氮白蛋白血液肌酸酐总胆红素和血清总蛋白高铁血红蛋白和胆碱酯酶等也可根据受试化学品毒性作用特点增加或减少指标尿常规体重脏器系数病理组织学检查心脑脾肺肾肝肾上腺甲状腺睾丸卵巢等评价评价不同剂量组动物有无异常现象反应发生率和严重程度之间的关系靶器官情况等最好提出无作用剂量或阈剂量
