1、GjT 19267.11-2003 90 前画GBjT 19267(刑事技术微量物证的理化检验分为12个部分:一一第1部分:红外吸收光谱法，一一第2部分z紫外可见吸收光谱法;一一第3部分z分子荧光光谱法，第4部分原子发射光谱法;第5部分原子吸收光谱法;第6部分;扫描电子显微镜法;一一第7部分:气相色谱-质谱法，一一-第8部分z显微分光光度法，一一第9部分:薄层色谱法，第10部分.气相色谱法;第11部分高效液相色谱法;第12部分热分析法。本部分为GBjT19267第11部分。本部分由全国刑事技术标准化技术委员会(CSBTSjTC179)提出并归口。本部分的起草单位:广州市公安局刑事科学技术研究所
2、。本部分起草人s卢培标。GB/T 19267.11-2003 1 范围刑事技术微量物证的理化检验第11部分:高效液相色谱法本部分规定了高效液相色谱的检验方法。本部分适用于刑事技术领域中微量物证的理化检验，其他领域亦可参照使用。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T19267的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 9008-1988 液相色谱法术语GB/T 13966-1992 分析仪
3、器术语GB/T 14666-1993 分析化学术语3 术语和定义3.1 3.2 GB/T 9008、GB/T13966、GB/T14666中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。高效液相色谱法high performance Iiquid chromatography( HPLC) 具有高分离效能的柱液相色谱法。色谱图chromatogram 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图或流动相流出体积的曲线图，或者通过适当方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。3.3 色谱峰chromatographic peak 色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。
4、3.4 峰高p回kheight 从峰的最大值到峰底之间距离。3.5 峰面积peak area 指峰顶至峰底之间的面积。3.6 分离度resolution 两个相邻色谱峰的分离程度，以两个组分保留值之差与其平均峰宽值之比R表示。R二2X (tR2 - tRl )/(W1十W2)91 GB/T 19267.11-2003 式中gtR一保留时间gW 峰宽。3.7 晌应值r届ponse组分通过检测器所产生的信号。3.8 灵敏度sensitivity 通过检测器的物质量变化b.Q时，响应信号tR的变化率，用5表示。s b.R/ b.Q 3.9 半离峰宽peak width at half height
5、通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。常用符号W，表示。3.10 3.11 压力梯度校正因子pressure gradient corr四tionfactor 用以校正色谱柱中由于流动相的可压缩性所产生的压力梯度的因子，用1表示。j 3/2 X CP,/Po) -lJ/CP，/P) -IJ 式中2P , 柱人口压力，MPa;P。柱出口压力，MPa，反梧液相色谱法reversed-phase Iiquid chromatography 固定相的极性较流动相的极性弱的液相色谱法。3.12 正相液相色谱法normal-phase Iiquid chromatograph
6、y 固定相的极性较流动相的极性强的液相色谱法。3.13 峰面积近似求法approximation of peak area 指使用手工的方法近似测量色谱峰的面积。对称峰:AhXW， 不对称峰:A二hXCWO 15 +WO.85 )/2 式中:h 峰高;W hlZ 半峰宽$WO. 15 为峰高0.15处的峰宽;W队的为峰高0.85处的峰宽。3.14 梯度洗脱gradient elution 间断地或连续地变更流动相的化学组分，从而改变液相色谱分离效果的洗脱方法。4 原理高效液相色谱法是以高压下液体为流动相的液相柱色谱法。它的色谱分离原理取决于所用的色谱92 GB/T 19267.11-2003
7、柱的性质，如液-液分配、液固吸附、离子交换、离子对等。与经典液相柱色谱相比，它具有流速快、分离效率好和检测灵敏度高的特点。5 仪器5.1 仪器名称高效液相色谱仪。5.2 仪器组成5.2.1 高效液相色谱仪一般由五部分组成:输液系统、进样系统、分离系统、检测系统以及数据系统。5.2.2 色谱柱a) 液液色谱法固定相它的固定相为化学键合固定相即把固定相(DS、苯基、酷基、胶基、氨基等)通过化学键合的方法接在担体(多为硅胶)上;b) 液固吸附色谱法固定相:采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛和聚酿胶等;c) 离子交换色谱法固定相:有二种，即薄膜型离子交换树脂(薄壳玻珠为担体)和离子交换键合固定相(用化
8、学反应将交换基团结合在惰性担体表面)，d) 排阻色谱法凝胶色谱固定相:分软质、半硬质凝胶和硬质凝胶三大类。软质，如葡萄糖凝胶，琼脂糖凝胶等适合水作为流动相$半硬质凝胶，如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶，适用于非水溶剂作流动相;硬质凝胶，如多孔硅胶多孔玻珠等，不易受水或非水溶剂流动相溶剂系统的压力、流速、pH值及离子强度的影响，适用于高流速的操作;e) 离子对色谱:能解离的熔质及其对离子(即平衡离子)均能分别溶于水相中，但当二者结合成离子对后，只溶于有机相中。常用的离子有:经基镀离子，如四丁基钱离子用于分离酸类，短基磺酸基类，如庚:皖磺酸纳用于分离儿茶盼胶类和表面活性剂，十二炕基磺酸用于分离有机胶
9、类化合物。在正相和反相柱上均能实现。5.2.3 检测器5.2.3.1 紫外检测器(UV)基于被分析试样对特定波长紫外光的选择性吸收。这是最常用的检测器，线性范围10，最小检测浓度达1010 g/mL。线性范围宽，对流速和温度变化不敏感。5.2.3.2 二极管阵到检测器(DAD)采用光电二极管阵列检测l元件，可在190nm950 nm之间快速扫描获三维色谱-光谱图。DAD灵敏度极高，对复杂试样的组分可同时进行多波长检测，并给出最佳定量结果。5.2.3.3 荧光检测器(FD)线性范围103，最小检测浓度达1012 g/mL。凡有发出荧光的化合物，或经衍生后可产生荧光的化合物均可进行检测。5.2.3
10、.4 示差折光检测器(RD示差折光检测器又称折光指数检测器，线性范围104，最小检测浓度达107 g/mLo 5.2.3.5 其他检测器除上述检测器外，还有移动丝氢火焰检测器(线性范围为10;，最小检出浓度为10-7g/mLl、电子捕获检测器(线性范围102，最小检出浓度为IO-Wg/mLl、以及红外吸收检测器、极谱检测器和放射性检测器等。5.3 主要技术要求5.3.1 色谱柱系树径为3m、5m和10flm，最佳为3m填料(多孔物如硅胶、氧化铝、高分子的多孔小球、或者是表面多孔的物质如固体硅珠上化学键合个薄薄的多孔层充填而成)。5.3.2 输送流动相的泵最高耐A为7000psi(480大气压)
11、，通常仪器压力上限操作在5000psi(350个大气压)。要求以恒流量泵输送液体，使保留时间保持不变。93 GB/T 19267.11-2003 5.3.3 液相色谱用的光学的和电化学的检测器(检测器检测极限一般在10物质的量10-甚至10-11物质的量)应该对压力波动不敏感。5.3.4 根据被测样品的量配用相应的环管进样器.批量样品的分析，贝u要求自动进样器。5.3.5 包括联接管路在内从进样阀到检测器应尽量减小柱外死体积，避免样品带的扩散而导致分离度的降低。5.3.6 整个色谱仪器系统必需耐腐蚀、无表面吸附，常用为不锈钢材料。除了常用的不锈钢材料外，也有采用全塑材料系统的，如聚囚氟烯材料。
12、6 检材处理和样晶制备6.1 检材处理必须根据被测样品的理化性质进行必要的处理，净化后溶解于适量的溶剂中才能进行HPLC检测。使用HPLC检测常见的微量物证，主要有=爆炸残留物中炸药，纤维上的染料分析，化妆品分析，粘合剂中防腐剂分析以及书写材料的分析等等。常用的检材预处理是使用适当的溶剂将样品提取出来。如果基体并不是很复杂，则提取的样品溶液经过适当的浓缩即可进行HPLC分析。但是在一个复余的基体中则需要合适的样品制备，尤其是去除干扰比较大的那些物质，以便顺利地进行HPLC的分析。如去除分子量大于2000的水溶性化合物，可以使用凝胶色谱柱或透析膜g离子型的化合物可以用离子交换树脂进行样品制备;常
13、规的薄层色谱法可以起到预分离的效果g固相萃取法对微量样品的制备比柱色谱和薄层色谱的效果更为突出。6.2 样品制备经过提取、净化和浓缩后的样品首先经0.20m或0.45m的滤膜过滤，然后在氮气流下吹干，再用本次实验的流动相溶解，获得透明澄清的样品溶液，否则还需再次过滤。7 试验方法7.1 分离方法的选择7. 1. 1 根据试样的分子量、极性、溶解度、化学结构等选择合适的方法。7. 1. 2 分子量在2002000之间，可用液液分配色谱法或液固吸附色谱法。7. 1. 3 分子量大于2000.可用排阻色谱法。7. 1. 4 溶于水并能离解的化合物(如有机酸、有机碱等).采用离子交换色谱或离子对色谱法
14、。7. 1. 5 溶于有机溶剂的强极性化合物，用正相液-液分配色谱法。7. 1. 6 溶于有机溶剂的中等极性化合物，用反相液液分配色谱法或液固吸附色谱法。7.2 色谱柱的选择常规使用的分析柱管内径在4mm.8 mmo细管柱分析柱内径为1mm,._, 2 mmo 1 mm以下的内径则用于毛细管分析柱。管的内径决定了色谱分离的流速和样品的载量。色谱柱固定相的粒度通常有3m，5m、7m、10m等规格，常用的为5m或10mo在分离方法确定之后，根据具体化合物的类型按手册或样本选用具体的柱。对于微量物证的检材，大部分选择ca.C18烧基硅胶键合固定相柱，或者氨基、氨基硅胶键合固定相柱，用于反相或正相液液
15、分配色谱法。7.3 流动捆的选择7.3.1 流动相的组成7.3. 1. 1 洗脱剂能使试样溶解，并达到各组分分离的溶剂。7.3. 1. 2 调节荆调节保留时间的长短，改善试样组分的分离状态。常用的调节剂有醇、嗣、酸、醋、酷和胶类等。94 7.3.2 流动相的性质7.3.2.1 强度液固吸附色谱法中溶剂的强度是分离条件的首选参数。7.3.2.2 极性液液分配色谱法中溶剂的极性是分离条件的首选参数。GBjT 19267.11-2003 正相色谱系统:选择非极性的溶剂作洗脱剂，如正己烧、正庚烧、环己:皖等，用乙醇、异丙醇、四氢峡喃、二氯甲:皖作调节剂;反相色谱系统2选择水作洗脱剂，常用甲醇、乙脯作调
16、节剂。溶剂的极性顺序为水、乙腊、甲醇、乙醇、异丙醇、丙阁、四氢映喃、乙酸乙醋、乙醋、工氯甲烧、三氯甲饶、二氯乙:皖、苯、正己饶、正庚烧。7.3.2.3 pH值离子对色谱法中一般采用缓冲液作流动相，因为pH值直接影响流动相中离子的形成及离子对与固定相作用的程度，故要严格控制。7.3.2.4 溶解性能排阻色谱法中首先要考虑流动相对试样的溶解性能，为此，有时不得不选用教度较大的溶剂，如乙醇、正己皖、四氢映喃等作流动相。7.3.3 流动捆的选择要求选用流动相的溶剂应避免引起柱效损失;避免保留时间变化;不能与被分离的组分起反应，应考虑榕剂的纯度，至少使用分析级以上的。必要时使用液相色谱级的，如甲醇、乙脯
17、。选择流动相应考虑溶剂的强度、极性、秸度、沸点、溶解度和pH值。这些因素对色谱性能均有不同程度的影响，但是对不同的色谱模式而言，有起主导作用的因素。7.4 仪器性能检查7.4.1 初步检查在对样品进行检验前，按照仪器的操作手册对仪器的性能进行详细的检查，使仪器处于良好的性能下进行操作。7.4.2 输出压力最高输出压力在35MPa/cm250 MPa/cm 0 7.4.3 流量精度在O.1 mL/minlO mL/min的范围内精度:t:l%。7.4.4 基线噪声和漂移低噪声的基线是呈绒毛状的平稳直线。漂移的大小是以一小时内连续测定信号的变化作为量度。7.4.5 柱的性能利用上一次试验的结果，计
18、算理论板数至少在2000以上。7.5 试验过程7.5.1 流动相脱气流动相的水和溶剂分别通过0.45m用于水相和有机相的滤膜，然后混合。除仪器本身附有脱气装置外，都需进行脱气。通常有二种，一为搅拌下真空抽气10min，一为超声波脱气。后者在超声浴中15 min-20 mino 7.5.2 冲柱检测前，都用本次试验的流动相以1mL/min的流量，等度或梯度模式冲柱15min以上，直到获得稳定的、低漂移的基线。7.5.3 注射通常用手动六通阀的环管进样(如罗达因阀，Rheodyne)。环管的体和、是固定的，有O.5L GB/T 19267.11-2003 100L适于定量分析。非制备性的进样量一般
19、为1IL10 IL.取决于样品浓度。7.6 定性分析在相同的条件下(温度、流速、柱负荷等)，化合物的保留体积或保留时间是相同的，其标准偏差为2%。因此，可以用已知标准品进行对照。在不很复杂的体系中，若被测样品的组分与标准品的保留值相同，则可能为同一物质。7.7 定量分析7.7.1 归一化法7.7. 1. 1 校正因子测定基于等量的不同物质在同一检测器上的相应值不同，故需要引人校正因子。准确称取一定量的被测组分纯品和标准物，混合均匀后溶于合适的溶剂或者分析所用的流动相中。分别测得相应的峰面积，按下述公式计算各被测组分的校正因子:式中21，一组分z的相对校正因子;f，一一组分z的绝对校正因子;1
20、标准物5的绝对校正因子;W , 组分z的量;A, 组分2的峰面积;W.一一标准物s的量gA 标准物s的峰面积。7.7. 1. 2 归一化的含量计算fgzL=Ws A f. W、XA，在相同的分析条件下，试样中全部组分都显示出色谱峰时，测量的全部峰面积经相应的校正因子修正并归一化，按下式获得每个组分的百分含量zC，(%)二A，j，j(A1fl十A，f2十Ad3+Af)X 100% 式中2C，-i组分的百分含量;A，-i组分在试样实测时获得的峰面积。7.7.2 外标法使用与待测组分同质的纯品配制成具有梯度浓度的标准溶液，建立标准溶液与其相应的相应值(峰面积)的校准曲线。在相同的分析条件下，准确注射
21、相同体积的试样并测出峰面积，然后从校准曲线上求得量。7.7.3 内标法选择一个合适的纯品作为内标物，它的性质与被测组分相近但与被分析体系中所有组分完全分离。准确称取一定量的被测组分纯品与内标物，分别溶于合适的溶剂或者分析所用的流动相中，并配制成定浓度的贮液。将被测组分的贮液配制成具有梯度浓度的标准溶液，并使每种标准溶液含有等量的内标物。建立被测组分和恒量内标物的面积比与被调l组分浓度的校准曲线。在相同的分析条件下注射相同体积，内含恒量内标物的试样，测出二者的面积比，然后从校准曲线上求得量。B 结果表述检材谱图与比对样品谱图或标准谱图进行定性比较或含量测定后，给出检材与何种比对样品成分相同或不相同，以及含量范围的结论。此外，还应注明检视条件。96
