1、ICS 65. 120 B 20 远写中华人民共和国国家标准GB/T 20191-2006 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验Microbiological examination of Lactobacillus acidlo philus in feeds 2006-05-17发布中华人民共和国国家质量监督检验检痊总局中国国家标准化管理委员会2006-09-01实施发布GB/T 20191-2006 前言本方法主要参考GB/T16347-1996(乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验)，结合我国饲料中允许使用的乳酸菌的种类，以及参考乳酸菌的分类鉴定过程制定的。本标准的附录A为规范性附录。本标准由全
2、国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标准主要起草人:饶正华、李丽蓓、杨曙明、苏晓鸥。I G/T 20191-2006 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验1 范围本标准规定了饲料中嗜酸乳杆菌数的测定及鉴定方法。本标准适用于含有有益微生物嗜酸乳杆菌的各种饲料中嗜酸乳杆菌数量的测定。2 规范性引用文件GB/ T 14699. 1 3 设备和材料3.1 3.2 冰箱:OOC3. 3 恒温水浴:4。3.4 电炉:可调，、。3.5 吸管:容量3.6 3. 7 平皿:直d3. 8 4.1 4.2 4. 3 革兰氏染色液(见第4.4 3%过氧化氢溶液。4. 5
3、 桂基质试剂(见第A.4章)。4. 6 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。4. 7 明胶培养基(见第A.5章)。4. 8 乳酸杆菌糖发酵管(见第A.2章)。4. 9 七叶昔培养基(见第A.3章)。5 采样与试样制备凡是注日期的引用文件，其随后所有根据本标准达成协议的各方研究最新版来适用于本标准。5. 1 采样工具，如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。5.2 样品包装为袋、瓶或罐装者，取完整未开封的。样品是固体粉末，应边取边混合;样品是流体，通过GB/T 20191-2006 振摇即可?昆匀。样品送到微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h。如果路途遥远，可将试样于OOC 50C
4、中保存(如冰壶)。5.3 采样数量和方式按GB/T14699. 1执行。6 嗜酸乳杆菌数的测定6. 1 检验程序嗜酸乳杆菌数检验程序如图1: 配成几个适当倍数的稀释液选择2个3个适当稀释度，各以1mL量加入灭离平皿内每皿内加入适量改良MC培养基圈1嗜酸乳杆菌数检验程序6.2 操作步骤6.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的试料25g(或25mL)放入含有225mL灭菌生理盐水(见第A.7章)的灭菌广口瓶内配成1: 10的均匀稀释液。6.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1: 10稀释液1mL.沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水(见第A.7章)的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)。6.2.3 另
5、取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL 灭菌吸管。6.2.4 选择2个3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 mL稀释液于灭菌平皿(3.7)内，每个稀释度作两个平皿。6.2.5 稀释液移入平皿后，应即时将冷至500C的改良MC培养基(4.1)注入平皿约15mL.并转动平皿使混合均匀。同时将计数培养基倾入加有1mL稀释液试料用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。6.2.6 待培养基凝固后，翻转平板，置360C土1oC恒温培养箱(3.1)内培养7
6、2h士1h取出，观察菌落特征，选取菌落数在30300之间的平板进行计数。6.3 菌落特征嗜酸乳杆菌在改良MC培养基(4.1)上菌落生长形态特征见表1。2 表1嗜酸乳杆菌在改良MC培养基上的菌落特征菌落特征GB/T 20191-2006 平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2mm土1mm，可有淡淡的晕7 嗜酸乳杆菌的鉴定7. 1 菌种制备z自平板上挑取单菌落，接种于改良MC培养基(4.1)斜面，于360C士lOC，24h48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。7.2 进行革兰氏染色，显微镜(3.9)检查，并做过氧化氢酶试验。嗜酸乳杆菌应为革兰氏阳性，无芽抱，过氧化氢酶阴性的杆菌
7、。进一步鉴定需做硝酸盐还原、明胶液化、产麓基质、产硫化氢和碳水化合物发酵试验。嗜酸乳杆菌极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生蘸基质和硫化氢。7.3 嗜酸乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果及其与干酷乳杆菌和植物乳杆菌的区别，见表2。表2饲料中常用乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果菌种名称七叶昔纤维二糖麦芽糖甘露酶水杨昔山梨醇棉籽糖煎糖嗜酸乳杆菌+ + + + d + 于酷乳杆菌+ 十d + + + d 植物乳杆菌十+ + + + + + + 注1:+一阳性;一阴性;d 有些菌株阳性，有些菌株阴性。注2:本表中列出干酷乳杆菌与植物乳杆菌的碳水化合物发酵是为了与饲料中允许使用的其他乳杆菌相区别。嗜酸乳杆菌与
8、二者碳水化合物发酵试验的主要区别在于甘露醇和山梨醇试验。8 结果计算及表述菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定(见第7章)，根据证实为嗜酸乳杆菌菌落数计算出该皿内的此菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此菌数，按式(1)计算:A=BX号xj.( 1 ) 式中zA 测定的嗜酸乳杆菌菌落数，单位为菌落形成单位每克(du/g)或菌落形成单位每毫升(du/mU;B一嗜酸乳杆菌的可疑菌落总数;C一-5个鉴定的菌落中确认为嗜酸乳杆菌的菌落数;f一一稀释倍数。例如含有嗜酸乳杆菌的试料中10-6稀释液在改良MC培养基平板上，生成的嗜酸乳杆菌可疑菌落为100个，取5个鉴定，证实为嗜酸乳杆菌的是4个，则由1g试
9、料中含嗜酸乳杆菌菌数为:100X X 106=8.0X107。3 GB/T 20191-2006 A.1 改良MC培养基A.2 乳酸杆菌A.3 A.4 A. 4.1 蛋白陈水A. 4.1 . 1 成分膜蛋白陈DL色氨酸A. 4.1.2 制法10 g 1 g 附录A(规范性附录)培养基及染色液牛肉浸膏氯化铀蒸馆水5 g 20 g 10 g 5 mL 5 g 0. 5 mL 1. 4 mL 1 g 0. 5 g 100 mL 5 g 1 000 mL 将上述各成分溶解于1000C水中，过滤，校正pH7.5，分装于小试管中，每支5mL , 121 oC高压灭菌15 min。A.4.2 柯凡克试剂A.
10、 4. 2.1 成分对二甲氨基苯甲醒戊醇A.4.2.2 制法5 g 盐酸75 mL 将对二甲氨基苯甲醒溶于戊醇中，然后缓缓加入浓盐酸。A.5 明胶培养基A. 5.1 基础成分CpH7.0)蛋白陈葡萄糖蒸锢水A. 5. 2 盐溶液成分无水CaClzA. 6.1 草酸接结A液:结晶紫4lg，B液:草酸镀0:混合A液和BA. 6. 2 番红染色液番红2.5g , 95 % 取上述配好的番红A. 6. 3 确液腆片1g，腆化拥2g，在先将腆化饵溶解在少量ZA.7 生理盐水在1210C下灭菌15min o 1 g G/T 20191-2006 25 mL 1. 0g 4.0 mL 1. 0g 1(，主边搅拌一边缓慢加5 CON-F-ONH阁。华人民共和国家标准饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验GB/T 20191-2006 国由l略中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销当陪印张0.75字数11千字2006年8月第一次印刷1/16 2006年8月第一版开本880X12309峰定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-27873 GB/T 20191-2006
