1、gB ICS 65. 120 B 20 中华人民共和国国家标准GB/T 20196-2006 的测定素霉盐饲料中Determination of salinomycin in feeds 2006-07-01实施2006-02-24发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会GB/T 20196-2006 目5吕本标准在查阅国内外文献基础上.提出饲料中盐霉素测定的两种方法。第一法为微生物检验法(仲裁法).微生物检验方法主要参考了我国原进出口商品检验局SN 06731997l999报导高效液相i普柱前衍生化法测定动物饲料中拉沙里霉素、莫能霉素、盐霉素、甲基盐霉素制定。其
2、方法原理、基本操作步骤相间，方法的范围、试样称样最根据试验进行了改进，改进技术内容如下:本标准范围适用于配合饲料、浓缩饲料、预说合饲料、盐霉素预混剂，较文献扩大:一一本标准称样量、盐霉素提取液稀释度见附表A。以上两种方法均增加了重复性。本标准的附录B、附录C为规范性附录.附录A为资料性附录。本标准由全国饲料标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(武汉)。本栋准起草人:刘小敏、张勇、高利红、何一!睐。G/T 20196-2006 饲料中盐霉素的测定1 范围本标准规定了饲料中盐霉素的微生物检验方法和高效液相色谱仪柱前衍生化检验方法。本标准两种方法均适用于配合饲料、浓缩
3、饲料、添加剂预混合饲料中盐霉素的测定。最低检出限为1. 25 mg/kgo其微生物检验方法为仲裁法。本标准高效液相色谱柱前衍生化法也适用于盐霉素预i昆剂中盐毒素的削定。注1:1 000盐霉紊单位(u)相当于1mg的盐霉素(C2日70011)。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准.然而.鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 4789. 1 食品卫生微生物学检验总则GB/T 6682 分析实验室用水规
4、格和试验方法GB/T 14699. 1饲料采样3 方法1:微生物检验方法(仲裁法)3. 1 原理用甲醇和水提取试样中盐霉素.提取液过氧化铝层析柱净化.除去饲料中的干扰性物质。洗脱j夜经稀释(或浓缩)，利用试液中盐霉素与嗜热脂肪芽抱杆菌作用产生抑菌圈，根据抑菌阁大小用标准曲线法定量测定盐霉素含量。3.2 试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸铺水或去离子水或相当纯度的水。3.2. 1 甲醇溶液9十l(V十V)。3.2.2 氧化铝270目335目:经300C活化3h，于干燥器冷却备用。3.2.3 氧化铝层析柱将活化氧化铝装填入层析柱中(高20mm，内径10mm)，同时轻轻拍柱
5、至氧化铝表面不再下降。氧化铝的高度为8cm9 cm , 3.2.4 试验菌种嗜热脂肪芽抱杆菌(估Bi川fJ55必ter叩ot州hel川Ohilu川5va盯r.Cl idolact。3.2.5 盐霉素标准溶液3.2.5.1 盐霉素析、准配备溶班精确称取盐霉素饷标准品(含量94.1%)0.1063 g，置于100mL容量瓶中，用甲障;容解.稀释至刻度，摇匀，其浓度为1000g/mL置于OC冰箱中，有效期两周。3.2.5.2 盐霉素标准中间液准确移取10.00mL标准贮备液(3.2.5.1)于100mL容量瓶中.用甲醇稀释至刻度，摇匀.其浓度分别为100.0g/mL，当日自己制和使用。GB/T 20
6、196-2006 3.2.5.3 盐霉素标准工作溶液分别准确移取一定量盐霉素中间液(3.2.5.2)，用甲醇溶液(3.2. 1)稀释成浓度为5.00g/mL、10.00g/mL、15.00g/mL、20.00g/mL、25.00g/mL的标准工作液.其中5.00g/mL为参考放度的标准工作液。以上溶液须当日配制和使用。3.2.6 培养基按附录B中规定制备。3.2.7 菌悬浮液嗜热脂肪芽拖杆商接种于培养基I内.于(55土1)OC培养(17土1)ho于8000 r/min离心15min , 弃去上层液。加入适量生理盐水，离;玲蔚攒啡嗤嗨泉。最后加入30rnL生理盐水制成均悬浮液，于40C冰箱保存，
7、该溶液可使3.2.8 检定平板的制备在制平板前，先放上牛、佳用量进行预测试。巳(55士1)oC培养(l7:l:液用量为最佳用主丑。于灭菌平皿中。再注入已加制备。3. 3 仪器与设3.3. 1 高压灭3.3.2 恒温培3. 3. 3 旋转真3.3.4 振荡器3. 3. 5 离心机3.3.6 游标卡3. 3. 7 培养血:3.3.8 牛津杯:3. 3. 9 3.3. 10 实验室常用3.4 试样的制备0.28m孔筛，昆匀.装入密闭3.5 分析步黯3.5. 1 试液制备3. 5. 1. 1 微生物实验室的操作注意事项按GB4789. 1执行。培养基且，充分混合，于、完整的抑菌圈的菌悬，待其凝由后，制
8、成基，所用平板需当天3.5. 1. 2 准确称取一定量试样.精确至0.0001 g，于250mL具塞三角瓶中，准确加入20.0mL样品提取液(3.2.1)，在往复振荡器上振荡1h，静置片刻，全部转移到准备好的氧化铝柱(3.2.3)中，用样品提取液(3.2.1)不间断地洗脱。用100mL容量瓶接收至刻度。3.5. 1.3 根据提取液(3.5.1.2)中盐霉素预计浓度(依据标示晕、称样量和提取液童确定分取章，参见附录A)吸取一定量提取液(3.5.1.2)置于旋转蒸发器中.减压至干。加入适量样品提取液(3.2.1)稀1)可以用一次性使用的仪器代替可爱复使用的仪器。2 释，使试液中盐霉素含量为5g/m
9、L20g/mL。3.5.2 标准曲线的制备GB/T 20196-2006 以5.0g/mL液度的标准工作液作为参考浓度。标准曲线上的每个标准浓度各取3个检定平极为一组。在每个平板上放置6个牛津杯.使牛津杯在半径为28mm的困面上成600角间距。其中3个牛津杯滴加0.1mL的参考浓度.另3个滴加0.1mL其他一种浓度的标准工作液。参考放度溶液与标准浓度j容液要向南放置。4种被度的标准工作液共用12个检定平板。平均值(B)之袭来校正其他以i容液浓度为横坐在归方程。式中:标ifiB一一被A一被3.5.3 测定每份样?夜3.6 结果计算3.6.1 如样液呈如样液呈现抑菌霉素的浓度，再按式(2)如测定结
10、果为阳性，tl生物自显影法，参见酣录C), 3.6.2 饲料中盐霉素含量按式(式中:一一试样中盐霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); .绘制栋准曲线图或计算回为#8mm的因面上成后，在(55土1)OC培)。校正后.求其平查出(或计算出)相应盐时.尚需进行确证试验(可用( 2 ) L 从标准曲线上查出的试样液中盐霉素浓度，单位为毫克每千克(mg也g); 71一稀释倍数:m一一称取试样的，单位为克(g)。3.6.3 平行测定结果用算术平均值表示.保留3位有效数字。3. 7 重复性在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值:3 GB/T 20196一2006一盐霉素的含量4.00
11、 X 103 mg/同时，不超过算术平均值的15%; 一一盐霉素的含量4.00X 103 mg/kg时，不超过算术平均值的10%。4 方法2.高效液相色谱仪柱前衍生化检验方法4.1 原理用甲酵提取试样中盐霉素，以2，4-二硝基苯阱(DNP)为衍生剂，应用高效液相色谱柱前衍生化法、采用紫外检测器对饲料中的盐霉素进行测定。4.2 试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂。4. 2. 1 7l4.00X 103 mg/kg时，不超过算术平均值的10%。 GB/T 20196-2006 附录A(资料性附录)试样的称样量给出饲料样品标示量、称样童及盐霉素提取被稀释度示例。见表A.l、表A.2。表A.1饲
12、料样品标示最、称样量及盐霉素提取液稀释度(微生物检验方法)饲料类别预混合饲料浓缩饲料配合饲料饲料类别盐霉素2页i昆剂预混合饲料浓缩饲料配合饲料盐草草案标示量/(g/kg) 350 000 150 000 70000 30000 提取液稀释或浓缩倍数1. 0 1. 0 1. 0 20.0 30.0 1. 0 20.0 14.0 o. 5 100.0 20.0 6. 0 0.2 检测预计浓度/(g/mU 14.0 12.0 17.5 7.5 14 6 70.0 42.0 98.0 84.0 49.0 21. 0 19. 6 21. 0 7 GB/T 20196-2006 B.1 培养基IB. 1.
13、 1 成分蛋白陈肉浸膏氧化铀酵母浸膏琼脂水B. 1.2 制法附录B(规范性附录)培养基和试荆制备5.0 g 1. 0g 5.0 g 2.0 g 15.0 g 1 000 mL 将上述各成分子水中加热溶解，调节pH值7.4立0.1，分装于试管中，于121C灭菌15min。制成斜面备用。B.2 培养基EB. 2.1 成分膜蛋白陈葡萄糖酵母注音琼脂水B.2.2 制法5.0 g 1. 0g 2.5 g 15.0 g 1 000 mL 将上述各成分于水中加热蓓解，调节pH值7.0士0.1，分装于锥形瓶中，于121C灭菌15min。B. 3 生理盐水称取8.5 g氧化铀，珞子1L水中，于121C高压灭菌1
14、5min, 8 G/T 20196-2006 附录C(规范性附录)微生物检验方法确证试验C.1 原理确证试验采用生物自显影法，用标准品作对照，求Rf值，以确iE样液中存在的抑黯物是否确实是盐霉素。C.2 生物自里影法条件C. 2.1 薄层板硅股Q/YT257 85SG , 5 cmX20 cmo使用前于1l0C活化2ho C.2.2 点样量20L，点状。C. 2. 3 展开在饱和槽内进行。C. 2. 4 检测将每个样液及标准梅液分别点在四块薄层板上;先于每块薄层板下端2cm处划一条:基线;然后在这条基线上分别点20L样液和2.0g/mL盐霉素标准榕眩，试液和标准踏破点相距2.5cm，在展开缸中
15、用甲醇进行展开，直至海剂前沿线距板顶端1.5 cm处为止，取出薄层板，风干后备培养用。将薄层板水平置于高压灭菌的长方形培养皿中，在无菌条件下将已熔化并怜却至50C 55C的生物自显影用培养基H均匀地喷在其表面上，然后用10mL上述接种芽抱菌悬液的培养基E铺满整个薄层板，保持水平，待其凝固，于(55土l)C培养(17士l)ho经过培养后，在薄层板上与盐霉素标准液产生押菌阔的、Rf值相同位置上，显现抑菌圈者即证明抑菌物确是盐霉素。9 OON-白FONH阁。华人民共和国家标准饲料中盐霹素的测定GB/丁20196-2006国中7守中国标准出版社出版发行北京复兴门外三望河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销+ 印张1字数20千字2006年7月第一次印刷1116 开本880X1230 2006年7月第一版定价12.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号，155066 1-27757 GB/了20196-2006
