1、ICS 67.050 X 04 中华人民主t./、和国国家标准GB/T 20758-2006 牛肝和牛肉中辜醋、表辜自同、孕自同残留量的测定液相色谱-串联质谱法Method for the determination of testosterone, epi-testosterone and progesterone residues in bovine liver and muscle tissues-LC-MS-MS method 2006-12-31发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2007-03-01实施发布GBjT 20758-2006 , 前占一-同
2、本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位z中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人z庞国芳、林峰、林海丹、张美金、黄华军。本标准系首次发布的国家标准。I GBjT 20758-2006 牛肝和牛肉中辜酬、表辜自同、孕酣残留量的测定液相色谱m串联质谱法1 茹围孕酣为0.5g/kgo2 规范性引用文件下列文件中修改单不包括勘误否可使用这些文件GB/T 6379. 1 (GB/T 6379. 1-GB/T 6379. 性与再现性时基GB/T
3、 6682 3 原理牛肝和牛向中萃取桂净化，肝脏样4 试剂和材料除另有说明外，所用4. 1 乙腊t色谱纯。4.2 甲醇:色i普纯。4.3 叔丁基甲醒:色谱纯。4.4 正己蜿z色谱纯。4. 5 三氯甲:院。4. 6 甲酸接。纯，水为GB/T6682规定的4. 7 日臼葡糖昔酸酶和硫酸醋酶:H-2型，helix pomatiao i普-串联质谱测定方法e酣、表辜酣为O.1g/kg， 件，其随后所有的的各方研究是2部分1确靠标z总则与定义87) 鞭用C1B团相质谱制定。4. 8 磷酸盐缓冲破:1. 0 mol/L.称取13.6g磷酸二氢何榕于100mL水中，称取8.7g磷酸氢二挥榕于50mL水中，分
4、别取70mL磷酸二氢轩水溶液和28mL磷酸氢二饵水榕液，棍匀后调节pH值为5.0，置4C中可保存:周。4. 9 饱和氧化铀水榕掖。4. 10 水饱和乙酸乙酣。4. 11 辜酣、表辜酣、孕酣标准物质:纯度99%;筑代辜酣(也同辜酣)、m代孕酣Cdg-孕酣内标标准物质:纯度注98%，1 GBjT 20758-2006 12 标准储备榕液:100g/mL。准确称取适量的辜酣、表串酣、孕酣标准物质，用甲醇分别配制成100g/mL的标准储备搭瓶，一18C贮存，可使用6个月。4. 13 标准工作榕破:5g/mL。分别吸取5mL辜酣、表辜酣、孕酣标准储备禧液(4.12)至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容
5、，此标准工作榕攘的?在度为5g/mL一18C贮存，可使用6个月。4.14 握合标准工仲搭液:50g/L。分别吸取1.00 mL辜酣、表辜酣、孕酣标准工作准(4.13)至100mL 容量瓶中，以甲醇稀释并定容，此棍合工作榕攘的被度为50g/L.-18.C贮存，可使用3个月。4.寸5内标储备溶被.100g/mL。准确称取适量的筑代事酣(d5-串酣?在代孕酣(d9-孕酣)标准品，用甲醇分别配制成100g/mL的内标储备瞎攘，一18.C贮存，可使用6个月。4. 16 内标工作撞撞:5g/mL。分别吸取5mLj在代串酣(ds-辜酣)、?在代孕酣(dg-孕酣)内标储备搭被(4. 15)至100mL容量瓶中
6、，以甲醇稀释并定容。-18C贮存，可使用6个月。4. 17 内标?昆合工作榕掖.25g/L。分别吸取0.50mL J在代辜酣Cds-辜酣)、jJt代孕酣(d9-孕酣)内标工作陪被(4.16)至100mL容量瓶中，以甲醇稀释并定容。-18C贮存，可使用3个月。4. 18 基质混合标准工作陪被z根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围，吸取一定量的泪合标准工作榕液(4.14)和内标工作椿被(4.16)，用空白样品提取液配成系列被度的基质由合标准工作榕液。当天配制。4. 19 C18固相萃取柱:500mg , 6 mL。使用前依改用6mL甲醇、6mL水活化。4.20 硅肢固相萃取柱:200mg , 6 m
7、L。使用前用6mL正己烧活化。4.21 憾膜:0.2m.5 仪器和设备5. 1 掖相色i普-串联质谱仪，配有电喷雾离子掘，5.2 分析天平:感量0.1mg和0.01g. 5.3 匀质机。5.4 高速缸织匀浆机。5.5 低祖高速离心机:转速大于4-000 r/min。5.6 高速离心机z转速大于12000 r/min. 5. 7 超声破。5.8 旋涡振葫器。5.9 振荡7k捕。5. 10 氯气被缩仪。5. 11 固相萃取装置。5. 12 旋转蒸发器.5. 13 KD榷缩瓶。6 试样制备与保存6. 1 试样的制备取样品约500g用组织捣碎机捣碎，装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记。6.2 试样
8、的保存将试样于一18C保存、7 测定步骤7. 1 酶解准确称取5g试样，准确至0.01g，置于50mL离心管中，依次加入200L内标晦合工作溶被2 GB/T 20758-2006 (4. 17)、10mL磷酸盐缓冲破(4.8)，以14000 r/min均质30S，加人60L葡萄糖昔酸酶和硫酸醋酶(4.7)，氓匀30s，置于370C恒瘟振蔼水捕中酶解16h。7.2 提取酶解后的样品溶被(7.1)加10mL甲醇，棍匀2min，置f.J，k带中放置5mi口，在50C以4000 r/min 离心10min，上清液转移至50mL离心管中，下层沉淀再用5mL甲薛重复上述操作一次，合并上清液至上述50mL离
9、心管中，向离心管中加入15mL叔丁基甲酶，振摇5min，以4000 r/min离心5min, 上层榕液转移至125mL分搜漏斗中，下层榕被依次再用15mL, 10 mL叔丁基甲酷提取两次，合并上层踏破至上述分液漏斗中，加入10mL 饱和氧化铀;tj(榕掖(4.的，振摇30s ，静置分层，上层播液转移至梨形瓶中，在40.C旋转蒸发至干，残渣中加入1.5 mL甲醇，涡旋1mi丑，超声5mi口，再加入20mL 水，混匀，待净化。7.3 净化将样品提取液(7.2)转移至己活化的C1S圄相萃取柱(4.19)上，用5mL水搅捧梨形瓶，洗潦液合并至C1S固相萃取柱中，以运2mL/mn流速使样液通过固相萃取柱
10、，待样液过柱后，用5mL水淋洗Cl8固相革取柱，弃去淋洗瓶，用10mL甲醇将待测组分从C18圄相萃取柱上洗脱，洗脱液转移至梨形瓶中，在40.C旋转蒸发至干。肌肉样品用0.5mL甲醇潜解残攘，涡旋1min，加入0.5mL水泪匀，过O. 2m植膜，供擅相色谱-串联质谱测定。肝脏样品的洗胧液蒸干后，向梨形瓶中加入0.5mL三氯甲:境，涡旋1mn，加入5mL正己蝇，超声1min，然后转移至巳活化的硅肢固相萃取柱(4.20)中，以1mL/min流速使样液通过固相萃取柱，待样被过柱后，用5mL iE己院淋洗硅胶固相萃取柱，弃去淋搅辘，用6mL;tj(饱和乙酸乙醋(4.10)洗脱待测组分，洗脱破转移至KD接
11、收瓶中，在400C旋转蒸发至干，加0.5mL甲醇，涡旋1min，加入0.5 mL水棍匀，过0.2m捷膜，供被相色谱-串联质谱测定。精:取阴性样品，按7.1、7.2和7.3步骤制备空白样品提取液，用于配制系列基质海合标准工作榕液。7.4 测定7. 4. 1 耀相色i普条件a) 色谱柱:CI8色谱柱，5m, 150 mmX2. 1 mm(内径); b) 柱温:40C ; c) 进样量.20L;d) 流动相、流速及梯度洗脱条件见表10表1流动相、流速及梯度提脱条件时间/min流速/CmL/min)乙脯/(%)3 mmol/L甲酸钱/(%)0.00 0.200 30 70 10.00 O. 200 8
12、5 15 15.00 O. 200 85 15 15.01 0.200 30 70 23.01 O. 200 30 70 7.4.2 质谱条件的离子惊:电喷雾离子摞pb) 扫描方式t正离子扫描;c) 检测方式:多反应监测;d) 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质i普灵敏度达到检测要求;3 GB/T 20758-2006 喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵敏度;定性离子对、定量离子对、去族电压和碰撞能量见表20表2辜酣、表辜固和孕酣及内标物的质谱参数e) f) 定量离子对(m/z) 定性离子对(m/z) 碰撞能量/V去簇电压/
13、V采集时间/ms定量用内标物被测物名称35 289/97 39 39 35 65 65 100 7页代暴嗣289/97 289/109 289/109 289/97 表寒嗣宰翻38 主三10间的存时近中留接品保度样的融为% 37 35 34 士5054 7.4.3.2定量测定节椒、飞在仪器最佳工作条fr帆标物峰面积的比值为纵坐线，用标准工作曲线对样品法定量。辜酣、表靠酣和孕酣自目和孕酬的舔加披度及其平均回7.5 平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验7.6 回收率试验阴性样品中舔加标准椿液，按7.17. 3操作，测定后计算样品添加的回收率。筑代孕酣7.4.3 液相色i曹-串7. 4. 3.
14、 1 定性测定fmJ每种被测组H句EJM与标准溶被中对应崎i保标准棚中对应的道ii在对应的待测物。1战dil表3杭育315/109 允许的最大偏差相对离子丰度?在代辜酣(ds -祟嗣)?在代孕翻(d孕酣孕酣结果计算和表述8 ( 1 ) A Ci Ai ., v , , 1 000 x = C, X丁一x.:2_x寸旦X-X一一一 , A. , C,i A; m 1 000 结果按式(1)计算t式中:X一一一试样中被测物残留量，单位为微克每千克(g/kg);4 Cs一一基质标准工作榕液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mU;A一一试样榕液中被测物的色谱峰面积;As-基质标准工作潜液中被测物
15、的色谱峰面积;Cj一一试样榕液中内标物的故度，单位为纳克每毫升(ng/mL); Csi一一-基质标准工作溶液中内标物的被度，单位为纳克每毫升(ng/mU;ASj一一基质标准工作陪液中内标物的色谱峰面积;A;一一一试样梅被中内标物的色谱峰面积1V一一样被最终定容体积，单位为毫升(mL); m一一试样梅液所代表试样的质量，单位为克(g)。或盐盟盟219 精密度GB/T 20758-2006 本标准的精密度数以95%的可信度来计算确定的，重复性和再现性的值9. 1 重复性在重复性条件复性方程见表4化合物名辜酣表暴酣孕酣9.2 再现性在再现性条件下，获现性方程见表4和表50飞专E性限怡，被测物的含量范
16、围及重1,072 0 m+O. 026 8 性限R限R，被测物的含量范围及再6 GB/T 20758-2006 附录A(资料性附录)辜嗣、表辜固和孕酬的多反应监测(MRM)色i曹圄A. 1 孕酣标准物质的多反应监测(MRM)色谱圈，见图A.L10. 7孕翻3000 nu nu UU9 auabmmnu言【1000 。5 10 15 20 11 min 固A.1 孕酣标准物质的多反应监测(MRM)色i曾圄A; 2 辜酣、表辜酣标准物质的多反应监测(MRM)色谱图，见图A.2. 7 395 6 000 2 000 8.U辑朋8.9表靠窗。5 10 15 20 11 min 圄A.2辜酣、表辜酣标准
17、物质的多反应监测(MRM)色i曾围6 附录B(资料性附录)回收率辜酣、表事酣和孕酬的添加浓度及其平均回收率的试验数据，见表B.l。GBjT 20758-2006 表B.l皇嗣、表事固和孕隅的添加w.度及其平均回收率的试验数据(n= 10) 样品基质化合物名称添加水平/C闯/kg)平均回收率/(%)O. 1 101. 0 辜酣0.2 97. 3 O. 5 106.0 O. 1 95. 9 肌肉表毒翻0.2 86.4 0.5 105.0 O. 5 86.8 孕酣1. 0 86.1 2.5 99.4 O. 5 106.0 辜酣1. 0 103.0 2.5 102.0 O. 5 114.0 牛肝表率酣
18、1. 0 102.0 2. 5 118.0 O. 5 93.4 孕酣1. 0 86.5 2. 5 91. 8 CON-RONH筒。华人民共和国家标准牛肝和牛肉中晕酣、表辜酣、孕酣残留置的测定液相色i蕾串联质谱法GB/T 20758-2006 国申* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北衔16号邮政编码:100045 网址WW电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销4峰印张O.75 字数15千字2007年3月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2007年3月第一版定价14.00元* 书号:155066 1-28969 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)6853353320758-2006
