1、ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准GB/T 20760-2006 牛肌肉、肝、肾中的-群勃龙、萨群勃龙残留量的测定液相色谱m紫外检测法和液相色谱-串联质谱法Method for the determination oftrenbolo肘，p-仕enboloneresidues in bovine muscle , Iiver and kidney一LC翩UVmethod and LC-MS-MS method 2006-12-31发布2007嗣03-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检亵总局也士中国国家标准化管理委员会&叩前本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中
2、华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口。GB/T 20760-2006 本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国问北出入境检验检疫局。本标准主要起草人:庞国芳、郭春梅、王凤池、艾连峰。本标准系首次发布的国家标准。I GB/T 20760-2006 牛肌肉、肝、肾中的岱群勃龙、萨群勃龙残留量的测定液相色谱紫外检测法和液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了牛肌肉、肝、肾中命群辨喃喃蝴睡前酣色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛肌肉、肝、本标准的方法检出限:伊慧赣州勃龙的液相色谱-紫外翩翩酬色谱-
3、串联质谱法的检出限均为2g/kgo2 规范性引用文件下列文件中的条的修改单(不包括勘是否可使用这些文静的GB/T 6379.1 (GB/T 6379.1 GB/T 6379. 性与再现性的GB/T 6682 3 原理试样在pH=5.柱净化，用配有紫外4 试剂和材料除另有说明外，所用4. 1 甲醇:色谱纯。4.2 乙酸:色谱纯。4.3 乙腊:色谱纯。4.4 乙酸乙醋。4.5 环己烧。4.6 丙酣。4. Z 正己烧。GB/T 637 验室用水2部分z确件，其随后所有协议的各方研究z总则与定义7) (GPC)和硅胶4.8 日-葡葡糖昔酸酶和芳基硫酸醋。-glucuronaseand aryl suH
4、ata.$e): 100 000 unit/ro.L。4.9 乙酸乙醋十环己皖:50+50)。4. 10 丙酣+正己烧:10十90。4. 11 丙酣十正己炕:.$+70。4. 12 乙酸饷缓冲准:0.02mol/L, pH=5. 0。称取无水己酸饷0.82怠榕于50QmL水中，用乙酸调节pH=5.00 l GB/T 20760-2006 4. 13 a-群勃龙、-群勃龙标准物质z纯度注98%。4. 14 标准储备榕被1分别精确称取r群勃龙、日-群勃龙标准物质(4.13)各0.0100g，用乙腊(4.3)榕解并定容至100mL，配制成100月/mL的标准储备榕液。此榕液-18C冷冻保存，可使用六
5、个月。4. 15 t昆合标准工作榕破:取标准储备榕液(4.14)各5mL至50mL容量瓶中，用乙腊定容至刻度，配制成混合标准工作潜液，谁度为10g/mL，此梅被一18C冷晦保存，可使用三个月。4. 16 硅肢固相萃取柱:500 mg , 3 mL;使用前用5mL丙酣+正己烧(4.10)预处理，保持柱体温润。4. 17 O. 45m擂膜。5 仪器和设备5. 1 被相色谱仪配有紫外检跚器。5.2 植相色谱串联质谱仪z配有电喷雾离子源(ESD。5.3 凝股色谱仪c5.4 均质器。5.5 旋转蒸发仪。5.6 旋涡混合器。5. 7 离心机:最大转速5000 r/min. 5.8 氮气故缩仪。5.9 恒温
6、水浴摇床。6 试样的制备与保存6. 1 试样的制备牛肌肉、肝、肾组织用组织捣碎机绞碎，分出0.5kg作为试样备用。6.2 试样保存制备好的试样置于一18.C冰柜中避光保存。7 测定步事7. 1 嚣合基质标准校准溜液的制备7. 1. 1 试样的称取勒:取5个阴性样品，每个样品为5g(精确到O.01 g)，置于50mL具塞离心管中，再分别加人不同量掘合标准工作榕被(4.1日，使各被测组分的被度均为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL。7. 1. 2 提取向上述盛有5个阴性样品的50mL具塞离心管中，加入5mL乙酸铀缓冲液(4.12)和20L-葡萄糖昔酸
7、酶和芳基硫酸醋(4.8) ，摇匀后盖好塞子置于恒温水描摇床(5.的上，37C振荡水解过夜(注5h)。待水解被冷却至室温后，加入20mL乙酸乙醋，在均质器(5.4)上以10000r/min的速度均质提取1min后，3000r/min离心(5.7) 10 min，将上清液过掳至鸡心瓶中。再用20mL乙酸乙醋重复提取一次，合并上清被于同一鸡心瓶中。7. 1.3 净化7.1.3.1 凝肢色谱仪(GPC)条件a) 净化柱:22g S-X3 Bio-Beads填料，200目400目，200mmX25 mm (内径)或相当者;b) 流动相z乙酸乙醋+环己皖(50十50)，流速5.0mL/min; 2 GB/
8、T 20760-2006 c) 定量环:5mL; d) 净化程序:0min10. 5 min弃去洗脱攘，10.5 min 15. 5 min收集洗脱攘，15.5 min18 min 弃去洗脱液。7. 1. 3. 2 GPC及硅肢固相萃取净化将提取液在450C下蒸至近干，用乙酸乙醋十环己烧(4.的定容至10mL的政璃试管中，按7.1.3.1中GPC条件净化。净化后将收集的洗脱液蒸干，用3mL丙酣+正己皖(4.10)旋涡振荡(5.6)搭解残渣，将榕液转移到预洗过的硅胶固相萃取柱(4.16)上的贮液器中，然后再用3mL丙酣十正己烧(10+90)府解一次，将合并的梅解液过硅胶固相萃取柱，接着用3mL丙
9、酣+正己烧(10十90)淋洗硅胶柱，最后用5mL丙酣十正己烧(4.11)洗脱分析物并收集。洗脱被用氮气被缩仪(5.8)在60C水浴中吹干，用1mL流动相旋涡振荡洛解，过0.45m掘膜(4.17)供液相色谱-紫外检测和被相色谱-串联质谱测定。7.2 试样溶液的制备称取待测样品5g(精确到0.01g)于50mL带塞离心管中，按7.1. 2和7.1. 3操作。7.3 空白基质溶液的制备称取阴性样品5g(精确到0.01g)于50mL带塞离心管中，按7.1. 2和7.1.3操作。7.4 液相色谱法测定7. 4. 1 液相色i普条件的色谱柱:Diamonsil C18 ，5m，150 mmX4.mm (内
10、径)或相当者;b) 流动相:0.1%乙酸水榕液-乙腊-甲醇(50+20+30); c) 流速:1. 0 mL/min; d) 检测波长:345nm; e) 柱温:400C ; f) 进样量:50L7.4.2 色i曹测定在仪器最佳工作条件下，对基质棍合标准校准潜液进样，以峰面积为纵坐标，基质1昆合校准梅液撒度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品榕被中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，-群勃龙、-群勃龙的保留时间分别约为11.2 min和13.4 min。标准物质的液相色谱图参见图A.1。本方法的添加回收率数据参见表B.L7.5 液相色i普-串联质
11、谱法测定7. 5. 1 液相色谱条件a) 色谱柱:Inertsil C18, 5m，150 mmX2.1 mm (内径)或相当者;b) 流动相:0.1%乙酸水榕液十乙腊(62十38);c) 流速:0.3mL/min; d) 色谱柱温度:350C ; e) 进样量.20L。7.5.2 质谱条件a) 离子漉ESl，正模式;b) 雾化喷嘴压力:0.24MPa; c) 干燥气流量:9.0 L/min; d) 干燥气温度:3500C;的毛细管电压、去集簇电压、碰撞电压等电压值应优化至最优灵敏度;f) 检测离子对见表103 GB/T 20760一2006表1被测物的保留时间、母离子和子离子被测物名称保留时
12、间/min母离子Cm/z)子离子(m/z)-群勃龙6.5 271 253 199 叶群勃龙7.2 271 253 199 a定量离子。7.5.3 定性泪u定每种被削组分选择个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待削物质的保留时间，与基质混合标准校准榕液中对应的保留日1柑菇主扫贺加d样品谱图中各组分定性离子的相对丰皮与战度接近的基质棍合标准校摊液谱图吧盟且JEF离子的和嘎严度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定为样% 相对离子卒度允许的相对误差7.5.4 定噩测定在仪器最佳工作度为横坐标绘制标器测定的线性范围本方法的舔加7.6 平行试验按以上步骤，7.7 回收率试验眼取适量
13、泪度的标准校准榕液。8 结果计算主主10土50合校准榕被放应值均应在仪7. 31稀释成所需浓率。式中zX一一试样中被削组分残留c一一从标准工作曲线得到的被V一一样品溶被最终定容体积，单位m一一样品榕液所代表最终试样的质量，单位为克(g)0 9 精密度本标准的精密度数据是按照GB/T6379. 1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。9. 1 重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，被测物的含量范围及重复性方程见表LnUXU AU丁HUAU-nu v-m C 一-X . ( 1 ) GB/T 20760-2006 表3两种群
14、勃龙的含量范围及重复性和再现性方程被泪u物名称含量范围/(问/kg)重复性限r再现性限R萨群勃龙2-40 19 r=O. 4376 19 m-O. 7122 19 R=O. 643 0 19 m-O. 526 7 m群勃龙2-40 19 r=O. 499 0 19 m-O. 754 3 19 R=O. 825 3 19 m-O. 7207 注:m为两次测定结果的算术平均值。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，被测物的含量植围及再现性方程见表305 GB/T 20760-2006 附录A
15、(资料性附录)标准物质液相色谱图A. 1 0:-群勃龙、R卢群勃龙标准物质的色谱图，见图A.l。3.0 2.5 2.0 1. 5 2 6 E -群勃龙0.5 1. 0 0.0 -0.5 o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 t I min 图A.lu-群勃龙、Jl-群勃龙标准物质的色谱图A.2 -群勃龙、-群勃龙标准物质的选择离子LC-MS-MS圈，见图A.20 Intens X105 2.。-群勃龙1. 5 1. 0 -群勃龙0.0 0 0.5 2 4 自8 10 n m / 固A.2岱群勃龙、协群勃龙标准物质的选择离子LC-MS-MS图6 附录B
16、(资料性附录回收率群勃龙的添加眼皮及其平均回收率的试验数据，见表B.l。表.l群勃龙的添加度及其平均回收率的棋验数据Cn=10)平均回收率/c%)被测物名称添加水平!C闯!kg)牛肉牛肝2 80. 7 79.5 -群勃龙5 82.1 84.0 10 81. 3 80.3 2 78. 5 81. 0 (-群勃龙5 82.4 81.2 10 83.2 80.3 GB/T 20760-2006 牛肾80.8 83. 2 80. 3 82. 7 81. 5 80. 8 DON-ohCNH曲。华人民共和国家标准牛肌肉、肝、肾中的伽群勃龙、萨群勃龙践自量的测定溜相色谱-紫外检制法和液相色i曹串联质谱法GB/T 20760-2006 国中峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销告奋印张0.75字数13千字2007年3月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2007年3月第一版定价14.00元9昏书号:155066 1-28970 如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/丁20760-2006
