1、ICS 65. 150 B 51 GB 中华人民共和国国家标准G/T 21443-2008 海湾、扇贝ay scallop 2008-02-15发布中华人民共和国国家质量监督检验检瘟总局中国国家标准化管理委员会2008-05-01实施发布GB/T 21443-2008 .u. 目。士一同本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位z中国科学院海洋研究所。本标准主要起草人z刘保忠、张国范、董波、阙华勇、尤锋、张晓军回I GB/T 21443-2008 海湾扇贝1 范围本标准给出了海湾扇贝CA
2、rgo户ectenirradians Lamarck)主要形态构造特征、生长与繁殖习性、遗传学特征以及检测方法。本标准适用于海湾扇贝的种质监测和鉴定。2 名称与分类2. 1 学名海湾扇贝Argopectenirradians Lamarcko 2.2 分类位置软体动物门CMollusca)，瓣盘里纲CLamellibranchia)，珍珠贝目CPterioida) ，扇贝科CPectinidae)，海湾扇贝属CArgopecten)。3 主要生物学性状3. 1 外部形态特征3. 1. 1 J卡形贝壳扇形，两壳几乎相等，右壳稍高，后耳大于前耳。前耳下方生有足丝孔，成体无足丝，绞合部相连且平直，肋
3、较宽而高起，肋上无棘。生长纹较明显。壳面有放射肋17条18条，壳面呈黑褐色、褐色、黄色或灰白色。成贝壳高6cm左右。海湾扇贝的外部形态见图10图1海湾扇贝外部形态3. 1. 2 可数性状壳面有放射肋17条18条。3. 1. 3 可量性状对于完长49.40 mm68. 70 mm，体重16.43 g36. 52 g的55个成体进行数量性状的测量，统计数据见表1。1 GB/T 21443-2008 表1海湾扇贝数量性状统计值性状平均值标准差壳长L/mm55.93 =4.41 3. 1. 4 体重、壳长生长关系式壳宽/mm23.67 士2.07海湾扇贝在自然条件下体长与体重关系见式(1), 式中=L
4、 海湾扇贝体重W阳3.2 内部构造特征3.2. 1 外套膜简单型外套膜，具封3.2.2 生殖系统雌雄同体，精巢4. 1 生长在适宜生长4.2 繁殖习性)年有春秋海湾扇贝繁期产卵量150X 101 9对，染色体臂数(NF)壳高H/mm53.82 士3.86，秋季为9韩体重W/g25.37 士5.23. ( 1 ) 月。4粒，一个产卵st BB tAI 战白蜡费费制晶黯冉集费向脚图2海湾扇贝染色体核型6 生化遗传学特征肌肉中苹果酸脱氢酶(MDH)同工酶为单态，酶谱见图302 7 分子遗传学特征16S rDNA序列(548. 1. 1 a) b) c) d) f) g) 8. 1. 2 染色体计数G
5、B/T 21443-2008 辑翻麟戴树镰附鹏制!点图3苹果酸脱氢酶(MDH)酶谱在显微镜下观察，计数100个以上清晰、分散良好的中期分裂相，测定染色体数目，统计得出二倍体染色体条数。8. 1. 3 核型分析选取7套10套染色体分裂相进行拍照、放大，测量染色体及其长臂、短臂的长度，计算其相对长度、臂比、臂指数、着丝粒指数。根据二倍体染色体相对长度、臂比、着丝粒指数，参照Levan的分类标准，得出二倍体的染色体核型公式。8.2 同工酶分析8.2. 1 样晶制备样本活体，解剖取其闭壳肌0.1gO. 2 g，加2倍体积的Tris-HCl缓冲液(0.01mol/L ,pH=7. 0)，并GB/T 21
6、443-2008 加适量处理过的石英砂冰上匀浆，然后在4C,12 000 r/min离心20min，取上清液分装后用于电泳。8.2.2 电泳方法采用淀粉凝胶TC缓冲系统Tris-拧橡酸，pH=6.9进行电泳分析。凝胶浓度为13%(质量分数), 胶制好后，样品加在靠阴极一侧，用滤纸蘸样品液插入孔中。电泳在4C冰箱内进行，电压120V，电流22 mA/板(TC)0 电泳结束后进行染色，染色液配方见附录B。8.3 DNA特征标记分析8.3.1 DNA的提取取闭壳肌300mg剪碎后，放入600L裂解液，55C水浴消化至组织、碎块完全裂解。裂解液分别用等体积的饱和盼、盼=三氯甲虫完(11)、三氯甲烧2异
7、戊醇(24 1)抽提，加入2倍体积的元水乙醇和终浓度10%的乙酸钩离心沉淀DNA，最后用70%的乙酶洗2次后晾干。裂解液配方见附录c8.3.2 片段克隆和纯化以提取的DNA为模板，利用两个特异性引物进行PCR扩增08.3.2. 1 引物序列f ,5-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3 r;5-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3 8.3.2.2 反应条件94C变性2min, 1个循环;94C变性30s，55C退火1min, 72C延伸1min，35个循环;72C延伸10 min , 1个循环。反应液配方见附录Co8.3.3 序列测定用基因自动分析仪测序，反应程序按照所使用
8、的测序试剂盒说明书给出的规程操作，最后读出16S rDNA的序列。4 GB/T 21443-2008 附录A规范性附录吉姆萨(Giemsa)染色液自己制A.1 Giemsa染色母液的配制称取0.5g Giemsa粉，量取甘泊33mL，在研钵中先用少量甘泊与Giemsa粉混合，研磨至无颗粒时再将剩余甘油加人，在56C条件下保温2h后，再加33mL甲晖，混匀，保存于棕色瓶内。A.2 磷酸缓冲液(0.2moI/L ,pH7. 2)的配制磷酸缓冲液由A液和B液按比例混合而成。A液(0.2mo!/L，Na，HPO，)配制z取36.61 g含1个结晶水的磷酸氢二锅(Na，HPO. H20)定容于1000
9、mL蒸馆水中，或取71. 64 g含2个结晶水的磷酸氢二纳(Na2HPO.2H20)定容于1000mL蒸馅水中，即可回B液(0.2mo!/L，NaH2PO，)配制=取27.6g含1个结晶水的磷酸二氢销(NaH2PO. H20)定容于1000mL蒸馆水中，或取31.21 g 含2个结晶水的磷酸二氢销(NaH，PO.2H，O)定容于1000 mL蒸馆水中即可。取A液720mL，加上B液28.0mL，混合即成所需的磷酸缓冲液。A.3 Giemsa工作染色液的配制取100mL磷酸缓冲液，加人3mL Giemsa染色母液即可囚附录B(规范性附录同工酶染液配方苹果酸脱氢酶(MDH)，DL-苹果酸锅，392
10、mg; 0.1 mo!/L Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)，2mL;1. 15 mo!/L MgCl, + O. 05 mo!/L NaCl , 0.4 mL; MTT(隆略盐)，4mg;PMS(N-甲基吩嚓甲基硫酸盐)，2.5mg;辅酶1，5mg。5 GB/T 21443-2008 附录C(规范性附录DNA提取裂解液和PCR扩增反应液组成C.1 DNA提取裂解液HB (10 mmol/L Tris-HC1, pH8.0; 100 mmol/L EDTA) SDS(十二烧基磺酸销)(10%)蛋白酶KC.2 扩增PCR反应液DNA模板6 10倍扩增缓冲液MgCl, (25 mmol/L) dNTP(10 mmol/L) 引物f(50pmol/L) 引物r(50pmol/L) Taq酶(5U/L) 加超纯水配制成25L的反应体系。540L 60L 100g 150 ng200 ng 2. 5L 2.0L O. 5L 0.5L 0.5L 0.2L
