1、. ICS 65.020-.0 1 B 16 哥哥中华人民共和回国家标准GB/T 29393-2012 柑桔黄龙病菌的检疫栓测与鉴定Detecthm. a.nd idenificatiol!1. of Cndidatus liberobcter asiticum 中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会2013-03-01实施发布目。吕本标准按照GB/T1. 1- -2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准佬赞术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、浙江省植物保护检疫局。本标准主要起草人:吴立峰、严铁、林云彪、项宁、朱景
2、全、朱莉。G/T 29393-2012 I GB/T 29393-2012 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定1 范围本标准规定了柑桔黄龙病菌亚洲种Candidtusliberobacter asiaticum jagoueix et al.的检测与鉴定方法。本标准适用于植物检疫过程中对柑桔黄龙病菌亚洲种的检测与鉴定。2 病菌基本信息中文名:柑桔黄龙病菌。学名:Candidatus liberobacter asiaticum jagoueix et al. 病害英文名:Ci trus H uanglongbing HLB。属薄壁南门Gracilicutes、韧皮部杆菌属Liberobacter 0
3、 3 方法原理根据柑桔黄龙病菌侵染柑桔植株发病典型症状进行田间鉴定;经嫁接或经柑桔木虱(Diahorinacitri)传病后，可根据木本指示植物发病症状鉴定;聚合酶链反应CPolymeraseChain Reaction , PCR)检测技术对柑桔黄龙病菌DNA进行体外扩增，可得到快速、有效的鉴定结果。4 仪器及用具紫外线透射仪或凝胶成像系统，离心机，核酸电泳仪，pH计，移液器:10L、20L、100L、1 000L，PCR仪，水浴器、超纯水系统，电子天平。5 试剂与材料TAE缓冲液，三(是甲基氨基甲烧-盐酸(Tris-HCl)，乙二胶四乙酸(EDTA)，十二皖基硫酸铀CSDS) ，乙酸铀(N
4、aAc)，Taq酶，10XPCR缓冲液，25mmol/L镜离子(Mg2勺，20mmol/L脱氧核昔三磷酸(dNTP)，5LDNA荧光染料CGV)，琼脂糖，澳酣蓝，高锚酸饵，三氯甲烧(氯仿)，异戊醇，异丙醇，乙醇。6 症状识别法柑桔黄龙病主要鉴定依据是田间出现的叶片斑驳型黄化和黄梢。叶片斑驳型黄化即叶片转绿后从主、侧脉附近和叶片基部开始黄化，黄化部分扩展形成黄绿相间分布不均的斑驳，后来可以全叶黄化。黄梢即在发病初期，绿色树冠上少部分新梢技叶片黄化。有些柑桔结果树果实呈红鼻子果。在柑桔黄龙病区符合上述典型症状的病苗、病树可直接鉴定为柑桔黄龙病。对难以下结论的疑似病苗、病树，可根据具体情况选用以下一
5、种或几种检测方法进行鉴定。1 GS/T 29393-2012 7 指示植物鉴定法7. 1 指示植物鉴定柑桔接穗带菌以槛柑作指示植物。鉴定时用带有23个病芽的接穗，在健康槛柑实生苗上进行嫁接。重复3次(嫁接工具每次使用前用高健酸饵溶液消毒)。待嫁接愈合后，在其上方约1m处剪除指示植物的主干。每株疑似病株至少嫁接30株以上健康槛柑，以健康槛柑实生苗作对照，定期观察、记载指示植物新抽枝叶的症状。一般柑桔黄龙病在指示植物上的潜育期为412个月。符合第6章所描述的发病症状可鉴定为柑桔黄龙病。指示植物鉴定丰从田间疑似病株植物症状。符合第6章描述的发病症状可鉴定接种柑桔木虱8 PCR检测法飞飞呐! 取样包括
6、疑似柑桔黄龙病l!Jl手Ht牛峡虱FEfH二点采来疑似书!丰占W龙肺口十每样品2，0张叶片，直接放于信封内(切忌塑料袋包装L呆呆无病树和1病树的高上柑桔水虱rN，虫每样品So100头，置于70%乙醇内陆泡2h3 h，然);1 J! :J 成于塑料但内，供检测。飞样品可以入i;冰箱保矿产。将取样阳明入植物灯/物叫8.2 8.3 、飞毛、/;刀I每个样品均柑进行们3次阳重复。条带 -._-._-._._ - / 出柑桔黄-. / 龙病9 记录与档案将检测结果填人表格植物有害生物样本鉴定报告)(见附录。，将检测的有关数据、图片等资料整理保存。10 标本保存柑桔叶片放入4.C冰箱保存和柑桔木虱浸70%
7、乙醇保存。2 . .; 生产/经营者联系/负责人调查日期样品编号抽样方法、部位和抽样比例:备注:抽样单位(盖章): 填表人(签名): 附录A(规范性附录)植物有害生物调查抽样记录表表A.1植物有害生物调查抽样记录表生产/经营者现场负责人年月日注:本单一式两联，第一联抽样单位存档，第二联交受检单位。G/T 29393-2012 编号:植物来源J 年月日3 GB/T 29393-2012 附录B(规范性附录)柑桔黄龙病菌PCR检测程序B. 1 病原物的提纯B.1.1 碱裂解法将待检柑桔木虱成虫50头放入200L管中或待检叶片取叶脉O.5 g剪碎后放入研钵，加入50 mmol/L Tris-HC1
8、, 10 mmol/L EDTA(pH:8. 0)，浸泣即可，磨碎;6 000 r/min离心3min，取上清液加入等体积O.2 mol/L NaOH十1%SDS，摇匀，冰浴放置10min;加入等上清液体积NaAc(pH:4.8 5.2) ，摇匀，冰浴10min; 11 000 r/min离心5min，取上清液加入22.5倍元水乙醇，一20.C30 min; 14 000 r/min离心15min，沉淀用75%、95%乙醇各洗一次，吹干，磷酸缓冲液(PE)溶解。B. 1. 2 Cl、AB法将待检柑桔木虱成虫或柑桔叶片取叶脉研磨成粉末状的干物质加入400L预冷的CTAB1提取缓冲液(100mmo
9、l/L Tris-HC1 , 10 mmol/L EDTA , 700 mmol/L NaCI, pH 8.0)中。加入500L65 .C预热的CTAB1I提取缓冲液(2%CTAB , 50 mmol/L Tris-HC1, 10 mmol/L EDTA , 800 mmol/L NaCl, pH8.0)混匀，65.C保温120min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷至室温后加入450L氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀至溶液呈乳浊状。12000 r/min离心2min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，加入5LRNase A储液，37.C下保温30mi口。依次加入600L异丙醇及60L乙酸铀溶液，轻缓颠
10、倒混匀。12000 r/min离心10min，沉淀DNA。弃上清液后，加入800L76%乙醇，12 000 r/min离心10min，弃上清液后，再加入100L70%乙醇洗涤沉淀，12000 r/min离心5mi口，沉淀DNA，除去残留的乙醇。DNA沉淀溶解于100LTE缓冲液中，4.C保存备用。B.2 检测体系柑桔黄龙病菌PCR检测体系见表B.1，体系总体积25L/管。表B.1柑桔黄龙病菌PCR检测体系检测试剂终浓度每管加入量L 10XPCR缓冲液1X 2. 5 25 mmol MgCl, 2.5 mmol 1. 75 10 mmol dNTP 0.2 mmol 2.5 10mol引物HLB
11、P10.5mol 0.2 10mol引物HLBP20.5mol 0.2 5 U;L Taq DNA聚合酶1 U;25L 0.2 模板DNAO. 41. 0g 5 ddH,O 12.65 总体积25 4 电 .10 , GB/T 29393-2012 lB. 3 PCR扩增PCR引物和反应条件见表B.2，用引物凹，P2进行扩增。表B.2PCR引物和反应条件病原柑桔黄龙病菌P1 TCTGTTTTCTTCGAGGTTGGTGA 引物12 ACCGCAAGACTCCTTACCAGGAAG 预变性94 oC预变性2min 扩增940C变性30s , 60 oC退火1min, 72 oC延伸1min PC
12、R反应条件循环数35个后延伸720C延伸10min 13.4 琼脂糖凝胶电泳在100mL TAE电泳缓冲液中加入g琼脂糖，加热融化后加入5LDNA荧光染料(GV)制各凝胶，凝罔后进行电泳。8L扩增产物加入2VL上样缓冲液，混匀后加入上样孔，80V恒压电泳，当澳酣蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳，紫外线透射检测。B. 5 凝肢成像观察与记录取出琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察，拍摄样品DNA扩增条带，记录观察结果，电子文档存档备查。5 GB/T 29393-2012 附录C(规范性附录)植物有害生物样本鉴定报告表C.1植物有害生物样本鉴定报告编号:植物名称品种名称植物生育期样品数址取样部
13、位样品来源送检日期送检人送检单位联系电话a 检测鉴定方法:检测鉴定结果.备注:鉴定人(签名):审核人(签名): 鉴定单位盖章=年月日注:本单一式三份，检测单位、受检单位和检疫机构各一份。6 , d NFONiEmum的mNH圈。、 华人民共和国家标准柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定GB/T 293932012 国由t奇峰中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销美印张O.75 字数13千字2013年3月第一次印刷开本880X12301/16 2013年3月第一版每16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107书号:155066. 1-46357定价GB/T 29393-2012 打印日期:2013年4月10日F002A
