1、ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 29394-2012 柑桔溃殇病菌的检疫检测与鉴定Detection and identification of Xanthomonas axonopodis pv. Citri 2012-12-31发布2013-06-01实施产码防气/中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局中国国家标准化管理委员会发布目lJ1=1 本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:全国农业技术推广服务中心、四川省植物检疫站、重庆大学。本标准主要起草
2、人z王福祥、宁红、谭家兴、项宇、郭迪金、王中康。GB/T 29394-2012 I GB/T 29394-2012 柑桔溃殇病菌的检疫检测与鉴定1 范围本标准规定了柑桔溃癌病菌CXanthomonasaxonopodis pv. Citri)的田间症状和实验室病原形态鉴定、免疫学和PCR检验的技术要求。本标准适用于芸香科植物检疫中柑桔溃癌病菌的检测和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GBjT 5040一2003柑桔苗木产地检疫规程3 术语和定义下列术
3、语和定义适用于本文件。3. 1 显症植株diseased plant 受柑桔溃茄病菌侵染，并已经表现症状的寄主植物。3.2 无症带菌植株副ymptomaticplant 受柑桔溃癌病菌侵染，但并没有表现症状的寄主植物。3.3 疑似症状suspicious lesion 部分符合柑桔溃癌病典型症状描述或与典型症状描述相近似的症状。4 柑桔溃痛病菌基本信息中文名:柑桔溃癌病菌。学名:Xanthomonas axonopodis pv. Citri Vauterin et al 19950 异名:X.camestrispv. CitriC Hasse) Dye 1978。病害英文名:citrus c
4、anker, Bacterial canker of citrus。属于黄单抱杆菌科，黄单抱杆菌属。柑桔溃癌病远距离传播主要是通过人为的引种，商品的流通。带病苗木、接穗和果实等繁殖材料是该病传播的载体。田间传播则是通过风雨、昆虫和农事操作等。柑桔溃癌病菌的相关资料参见附录Ao5 方法原理对于已形成柑桔溃癌病典型症状样品，由于典型症状易识别，且近似症状的病原菌为真菌(参见附GB/T 29394-2012 录酌，通过菌溢检查和革兰氏染色法，可直接进行鉴定;对于有疑似症状的样品，通过病原分离培养和接种试验可进行检验鉴定;间接ELISA检验主要用于疑似症状、不显症样品的检验鉴定;PCR检验主要用于以上
5、两种方法均不能确定时的检验鉴定，有条件的实验室也可直接用于疑似症状、不显症植株的检验鉴定。6 仪器及用具6. 1 症状及病原形态鉴定仪器及用具玻7. 7. 7. 天平、高压灭菌锅、超净工作台、培养箱、生物显微镜、体式显微镜、解剖刀、接种棒、培养皿、烧杯、载十飞今 /俨7.2.1 样品提取液:取L电g磷酸军三铀(NazHP04)、0.2g氯化饵(J5GlJ6.2 g磷酸二氢饵(KHzP04)、,-， / / 氧化铀(NaCl)、0.2g叠氮化铀启事风)，用f&mL蕴锢水溶解主并调整pH捕的.407.2.2洗涤:*1.15g存在学帆aZHP04)，0.2g氯例如t川三g磷酸二制(KHzP04)、8
6、 g氧化铀(NaCD、0.5g吐温-20，用1000 mL蒸馆水潜解，并调整pH值到7.407.2.3 封闭液:取5g无脂奶粉，用100mL样品提取液溶解。7.2.4 包被液:取2.93g碳酸氢铀(NazHC03)、1.59 g氯化铀(NaCD、O.2 g叠氮化铀(NaN3)，用1000 mL蒸锢水溶解，并调pH值到9.607.2.5 抗体稀释液:取2.5g脱脂奶粉、加100mL洗涤液溶解。7.2.6 抗体:兔抗柑桔溃茄病菌抗体球蛋白。7.2.7 酶标抗体:市售碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体球蛋白。7.2.8 底物缓冲液:用80mL灭菌蒸锚水将0.01g氯化镜(MgClz 6Hz 0)、0.02g
7、叠氮化铀(NaN3)、9.7mL二己醇胶(CHzCHzOH)溶解后，调pH值到9.8，定容到100mL。7.2.9 底物溶液:将5mg对硝基苯磷酸盐(CsHsN03)溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前10min内，避光条件下制备。7.2. 10 终止液:将12g氢氧化铀(NaOH)，用100mL蒸锢水溶解。GB/T 29394-2012 7.3 PCR检验试剂与材料7.3. 1 灭菌超纯水ddH2007.3.2 PCR缓冲液X10J。7.3.3 引物(primer): 上游引物(XAcF):5-ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3; 下游引物(XAcR):5人TCTG
8、ACCACATCGCATAGGA-3;用双蒸水稀辞至50mol/Lo7.3.4 dNTP25 mmol/LJ。7. 3. 5 MgC12 25 mmol/LJ 0 7.3.6 Taq酶5u/LJ。7.3.7 Marker:lOO bp DNA ladder(1 500 b抖。7.3.8 制样液z含0.3%亚硫酸铀(Na2S03)的水溶液。7.3.9 电泳缓冲液TBE5XJ:在1L水中加入Tris碱54g，跚酸27.5g , 20 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)，使用时稀释为1XTBE工作液。7.3. 10 琼脂糖凝肢2%J:在1XTBE工作液中加入2%的琼脂糖，融化后在每
9、100mL琼脂糖溶液中加入市售5LDNA荧光染料(GoldView) ，冷却至60.C倒入插入梳子的制胶槽中，冷却凝固后点样电泳。7.3. 11 样品缓冲液LoadingBuffer. 8 方法8. 1 症状及病原形态鉴定8. 1. 1 症状识别在寄主植物特别是柑桔类植物生长期，按GB/T5040-2003中第5章的要求，对苗圃和果园逐园、逐株进行田间症状目测踏查。按要求采集有典型症状和疑似症状的柑桔溃痛病样本进行室内检验鉴定。柑桔溃殇病典型症状参见附录B。调运检疫和市场检疫发现符合附录B描述典型症状和疑似症状的寄主样本，取样送实验室检验。8.1.2 菌溢检查切取具有典型症状和疑似症状病斑的病
10、健交界处小块组织，平放在载玻片上的水滴中，加盖玻片在低倍显微镜下检查，观察有无菌溢现象。如果有菌溢出现，再进行革兰氏染色。8.1.3 革兰氏染色检查到菌溢的载玻片将植物组织移去，水滴干燥后通过火焰固定，再用革兰氏染色法染色，观察染色反应。8.1.4 分离培养鉴定田间或其他检疫过程中取回的具有柑桔溃荡病疑似症状的样品，在无菌条件下取病健交界处组织约(2mm-3 mm) X (2 mm-3 mm)，经表面消毒后放入0.2mL无菌水中，用灭菌玻璃棒捣碎，在室温下浸泡5min-10 min，将悬浮液在煎糖蛋白陈培养基上划线，28c培养2d-4 d，观察病原菌形态特征和培养特性，柑桔溃癌病菌形态特征和培
11、养特性见附录C。3 GB/T 29394-2012 8. 1. 5 致病性鉴定将分离培养得到的纯培养菌株，用针刺涂抹法接种到健康的甜橙类柑桔新梢叶片上，在温度28.C 30 .C、相对湿度95%100%的条件下培养7d10 d，参见附录B观察发病症状。8.2 间接ELISA检验8.2. 1 取样疑似样品直接取样检验，无症样品田间取样方法见附录Do8.2.2 程序- -8.3 PCR检验麟菌间接?明附录E柑桔溃癌病菌PCR检验程序见附录古。/ 疑似样品8.3. 1 取样8.3.2 程序9 结果判定 / 9.2.2 用酶标仪测定光密度值在阴性对照反应孔的光密度值(OD)O.1、阳性对照反应孔OD值
12、大于厂家设定阳性OD值的前提下，样品反应孔OD值大于阴性对照孔OD值的2倍，判定为阳性反应，即样品带柑桔溃殇病菌;否则判定为阴性，即样品不带柑桔溃癌病菌。9.3 PCR检验在阴性对照元扩增条带、阳性对照出现一条278bp特异性条带的前提下，供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性扩增条带，样品判定为阳性，即带有柑桔溃癌病菌;供试样品未出现与阳性对照相同大小特异性条带，样品判为阴性，即不带柑桔溃痛病菌。4 GB/T 29394-2012 10 结果报告将实验室检验鉴定结果填入植物有害生物样本鉴定报告)(见附录F)。门除害处理检验过程中使用的有关试料和用具，在使用完毕后应进行消毒和除害处理;经检疫鉴
13、定后的样品，应在一800C至一20oC保存1个月，以备复验、谈判和仲裁，保存期满后，进行灭活处理。5 GB/T 29394-2012 附录A(资料性附录)柑桔渍痛病菌其他信息.1 分布亚洲的阿富汗、孟加拉、印度、巴基斯坦、斯里兰卡、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾、越南、缅甸、尼泊尔、老挝、柬埔寨、泰国、日本、韩国、朝鲜、马尔代夫、阿拉伯联合酋长国、也门;美洲的阿根廷、巴西、巴拉圭、乌拉圭、美国、墨西哥、伯利兹、多米尼加、海地、马提尼克、瓜德罗普;非洲的加蓬、马达加斯加、科摩罗、科特迪瓦、毛里求斯、莫桑比克、留尼汪;大洋洲的巴布亚新几内亚、斐济、关岛、马里亚纳群岛、密克罗尼西亚群岛等国家和地区均有
14、分布。尤以亚洲国家发病最为普遍。.2 寄主植物该病菌主要侵染芸香科野生的和栽培植物。在经济上造成经济损失最大的是柑桔。自然侵染主要发生在柑桔属植物上，也发生在金桔上。.3 危害情况柑桔溃痛病是柑桔重要病害之一，为国内外检疫对象。可危害叶片、枝叶和果实，苗圃发病，苗木生长不良，素质低下，出圃延迟;成年结果树发病，常引起大量落叶、落果，甚至枯梢，降低树势;未脱落的轻病果形成木栓化开裂的病斑，严重影响果品的外观和品质，降低了商品价值。6 GB/T 29394-2012 附录B(资料性附录)柑桔渍痛病及柑桔疮踊病症状特征B.1 柑桔渍痛病B. 1. 1 叶片症状病斑初时针头大、黄白色、油渍状、扩大后叶
15、的正反面都隆起、破裂，呈海绵状，灰白色，后病部木栓化，表面粗糙，呈灰褐色火山口状开裂。病斑多近圆形，周围大多有黄色晕圈和袖圈，老叶病斑黄色晕圈不明显。B. 1.2 枝条症状病斑近圆形或椭圆形，黄褐色，表面粗糙、隆起、无黄色晕环，几个病斑常可以愈合成片。干燥情况下，溃癌病斑海绵状、木栓化、隆起、表面破裂;潮湿时溃癌迅速扩大，表面完整，边缘油渍状。抗性品种在病健交界处形成愈伤组织层，通过用刀切去外部软木塞状物质而留下粗糙表面。在暗绿色健康组织里可见明亮至暗褐色病斑，变色区大小、形状、深浅均有变化。B. 1.3 果实症状病斑与叶片上的相似，但火山口状开裂更显著，木栓化程度更高，坚硬粗糙，幼果期有时可
16、见黄色晕圈，病部只限于果皮上，很少发展到果肉。果实生育前期发生的病斑多隆起，中、后期发生的则较扁平。B.2 柑桔疮躏病受害叶片仅一面出现隆起的近圆锥形病斑，另一面凹陷。病斑较多时，叶片扭曲畸形。病斑周围仅有黄色晕圈而无轴圈。果实受害后常长出许多散生或群生的瘤状突起，疮躏易脱落。7 GB/T 29394-2012 附录C(规范性附录柑桔溃痛病菌形态特征和培养性状C.1 形态特征菌体短杆状，两端钝圆，大小为(1.5m-2.0m)X(0.5m-0.7m)，极生单鞭毛，有英膜，无芽抱，革兰氏染色阴性，好气。C.2 培养特性病菌生长适温为25.C -30 c ，最低为5.C-10C，最高为35.C-38
17、 .C，致死温度为55.C-60 .C 10 mino在煎糖蛋白陈培养基(PSA)上，菌落初呈淡黄色，圆形，全缘隆起，表面光滑，周围有粘稠状白色环带。在牛肉汁蛋白陈培养基上，菌落圆形，蜜黄色，全缘，有光泽，表面稍隆起，粘稠状。8 D.1 取样方法附录D(规范性附录)柑桔溃爵病菌间接ELISA及PCR检验取样方法/ / / / / GB/T 29394-2012 9 GB/T 29394-2012 附录E(规范性附录)柑桔溃痛病菌间接ELISA检验程序E.1 制样E. 1. 1 植物样晶将供试样品剪成3cm2小片，装在小塑料袋中，按照供试样品质量(g):样品提取液体积(mL)=1 : 6的比例加
18、人样品提取液，用试管底部轻压叶片，静置浸泡5min。取1mL样品浸出液于离心管中，10 000 r/min离心2min，弃上清液。用样品提取液1mL悬浮沉淀，经10000 r/min离心2min，弃上清液;重复3次。E. 1.2 病原菌分离物用接种环挑取一环病原菌菌液，加入1mL样品提取液中混匀，经10000r/min离心2min，弃上清液;重复3次。E.2 包被E.2.1 加样在制备好的样品中每管加入200L包被液混合均匀，取100L加入酶联板各反应孔中，每个样品设3次重复。设置阳性对照、柑桔健康组织浸泡液和包被缓冲液为阴性对照。E. 2. 2 封闭将酶联板置于37.C的恒温箱中至酶联板反应
19、孔中的样品完全干燥。在每个反应孔中加入200L封闭液，置于密封且可保湿的容器中，25.C恒温孵育30minc E. 2. 3 洗板将反应孔中的液体倒出，用洗涤液加满每个反应孔，静置1min-2 min后，将洗涤液倾出，重复洗涤2次。洗板完成后将酶联板倒置于干净吸水纸上，吸干反应孔中的水分。E. 3 结合抗体E. 3.1 加抗体每孔加入100L用抗体稀释液按市售产品要求进行稀释的抗体，置于保湿容器中，25.C孵育1hc E. 3. 2 洗板在每个反应孔加入洗涤液，倒出，再加入洗涤液，静置3min后将洗涤液倒出。再重复2次。洗板完成后将酶联板倒置于干净吸水纸上，吸干反应孔中的水分。10 GB/T
20、29394-2012 E.4 结合酶标抗体E. 4. 1 加酶标抗体每孔加入100L用抗体稀释液按市售产品要求进行稀释的酶标抗体。孵育方法同E.3.LE. 4. 2 洗板同E.3. 20 E. 5 lm. . 显色后拉叫人止液飞E.7 结果记录:. E. 7.1 目测观察/ / 反应孔无颜色变化为阴性，记录为一;反应孔黄色为阳性反J应，记录为+，依色津的逐渐加深记E. 7. 2 用酶标仪测定光密度值/ OD值。卢 11 GB/T 29394-2012 附录E(规范性附录)柑桔遣痛病菌PCR检验程序F. 1 制样F. 1. 1 无症样晶取无症叶片样品1020片，放人自封式塑料袋中，加入制样液振荡
21、混匀后，置于25.C-28 .C摇床上振荡培养3h，吸取浸泡液2mL，经8000 r/min离心5mino弃去上清液，以试管底部约200L残存液，振荡?昆匀后作为待测模板。F. 1. 2 疑似样晶将可疑病斑1-2个浸入0.2mL制样液中，用灭菌尖头捣碎后，室温浸泡15min，静置上清液直接作为待测模板，亦可按常规方法提取DNA后作为模板。F. 1. 3 病原菌分离物用接种环挑取少量纯培养菌株的菌悬浮液(约1X 106 CFU/mL)，在离心管中用0.5mL制样液稀释混匀后作为待测模板。F.2 PCR检测F. 2.1 检测体系柑桔溃痛病PCR检测体系见表F.1，体系总体积25L/管。表F.1 柑
22、桔渍癌病菌PCR检测体系检测试剂终浓度每管加入量L 10XPCR缓冲液1X 2.5 50mol/L引物对0.25mol/L O. 125 25 mmol/L dNTPs 0.2 mmol/L 0.2 25 mmol/L MgCl. 2 mmol/L 2 5 U/L Taq酶1 U/25L l ddH,O 17.075 模板DNA2 总体积25 F. 2. 2 PCR反应依次将PCR缓冲液、引物对、dNTPs、MgC12、Taq酶、ddH20和待测模板按照表F.1体系浓度要12 . :. GB/T 29394-2012 求加入PCR反应管，混合均匀后放人PCR扩增仪。PCR反应程序为:95 .C
23、 4 minO个循环);94 .C 30 s , 58.C 30 s , 72.C 30 s(35个循环);72 c 7 min ,4 .C下保存。每次检验时同时设阴性对照和阳性对照管。F.3 电泳取出反应管，将PCR产物8L与样品缓冲液2L混合，加入琼脂糖凝肢的点样孔中，同时设Marker作为片段大小标准。在lXTAE电泳缓冲液中、80V电压下，电泳40min F.4 凝胶成像观察与记录取出琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察，拍摄样品PCR扩增条带，记录观察结果，电子文档存档备查。13 NFON|叮gNH阁。. J 人民共和国家标准柑桔溃痛病菌的检瘟检测与鉴定GB/T 29394-2012 国华
24、中. 副t, * 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1.25 字数26千字2013年4月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2013年4月第一版* 书号:155066. 1-46462 21. 00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价GB/T 29394-2012 打印日期:2013年4月18日F002
