1、道BICS 65.020.01 B 16 和国国家标准11: ./、中华人民GB/T 29429-2012 J 草莓角斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xanthomonas fragariae Kennedy & King 2013-03-01实施2012-12-31发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会于俨札/咱防轧相时-4数中华人民共和国国家标准草莓角斑病菌检瘟鉴定方法GB/T 29429-2012 导中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045
2、)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销晤开本880X 1230 1/16 印张o.75 字数16千字2013年4月第一版2013年4月第一次印刷晤书号:155066. 1-46359定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107d GB/T 29429-2012 目。昌本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国江苏
3、出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:刘天鸿、邵秀玲、赵文军、杨万风、厉艳、魏厚德、沙天慧、孟祥龙。I . G/T 29429-2012 草莓角斑病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了草莓角斑病菌Xanthomonas卢agariaeKennedy &. King的检疫鉴定以形态学特征、生物学特征和PCR特异性反应为依据，明确了样品采集、病原菌分离、致病性测定、PCR反应、样品保存的方法。本标准适用于草莓种苗中草莓角斑病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件
4、。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789. 28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程3 草莓角斑病菌基本信息中文名z草莓角斑病菌。学名:Xanthomonas卢agariaeKennedy &. King 0 病害英文名:Angular leaf spot of strawberry 0 属于原核生物界Procaryote，薄壁细菌门Gracilicutes，暗细菌纲Scotobacteria ，假单胞杆菌科Pseudomonadaceae，黄单胞杆菌属Xanthomonas0 该病菌可通
5、过雨水和田间灌溉飞溅作局部传播、扩散，携带病菌的草莓苗以及夹杂在草莓苗中的病残体都可能随贸易作短距离和长距离的运输传播。草莓角斑病菌的其他信息参见附录A。4 方法原理根据草莓角斑病菌的危害症状采集样品，通过实验室分离、培养和致病性测定，以及分子生物学测定等方法，依据病害的症状、病原菌的形态特征、生物学特性、生化特性、致病性测定，以及分子生物学特征进行判定。5 仪器和用具生物显微镜、生化培养箱、高压灭菌器、电子天平(感量0.01mg)、恒温振荡培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳装置、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、移液器、移液器枪头、研钵、量筒、烧杯、培养皿、PCR管、离心管、接种针、玻璃棒、剪刀等
6、。6 主要试剂蛋白陈、酵母膏、煎糖、葡萄糖、琼脂粉、冰乙酸、乙醇、乙二胶四乙酸(EDTA)、十六烧基三乙基澳化GB/T 29429-2012 镀CCTAB)、三楚甲基氨基甲烧CTris)、十二烧基磺酸铀CSDS)、液氮、酣、三氯甲烧、异戊酶、异丙醇、琼脂糖(电泳用)、漠化乙链CEB)、TaqDNA聚合酶、氯化饵CKCl)、磷酸氢二饵CKzHP04)、氯化铀CNaCl)、磷酸氢二铀CNazHP04)、氯化镜CMgClz)、硫酸镜CMgS04 7Hz 0)、硝酸铀CNaN03)、乙二胶四乙酸铀CNazEDTA)、澳酣蓝、蛋白酶K、RNaseA、10XPCR缓冲液、dNTP(dATP、dTTP、dC
7、TP、dGTP)。7 检瘟鉴定方法7.1 现场检瘟抽样数按SN/T1157中规定的方法进行。川三:=_._._.-, 在现场检疫时，应仔细持查草莓草叶和茎有无病变症状,.L:_(,_ .r r./ 形病斑、叶背溢出菌脏、植株生长点变黑等可疑症状时，应取/ / . / / . -/ 红褐色干枯病叶或生长点死立的植株，当发现可/1. / . . 疑症7.2 扩选取新发病的、带有水渍状病斑的病叶，用70%的乙醇丑洗后碾碎，置于PBS缓冲溶液(参见附录初中rOmin.15ino在无菌操作条件下吸取稀释液均匀涂布于WILBRINKN培养基参见附录B)平板上，置于250C培养5d7 d，然后再进行三次的纯
8、化，最后获得纯菌株。/ 、/7.3 病原菌形态观察及生理生化测定 / 7.3.1形态平气/ 对分离纯化驳得的纯菌株，经染色制成玻片，在显微镜F飞飞7.3.2 将察菌落H;JV.xL.,J IH .lVrV-o 7.3.3 生理生化测定该菌生理生化测定见附录C。7.4 致病性测定将WILBRINK-N或YPGA培养液(参见附录B)中培养3d5 d的菌株，用PBS缓冲溶液稀释到109 CFU/mL，选取完全健康的草莓感病品种，用蘸取悬浮液的接种针小心地扎刺新生叶面，每片叶扎刺510次，最好不要扎穿叶子，设置五个重复，以PBS缓冲溶液为对照。接种后用塑料袋罩住植株，使植株置于20oC25 oC、相对
9、湿度注80%的隔离温室里生长4周，每天观察并记录发病情况，出现症状后，用7.2方法进行病原菌再分离、纯化。7.5 PCR法检测该检测方法见附录D。2 a、.G/T 29429-2012 8 鉴定特征8. 1 症状特征经检疫鉴定后，应妥善保存样品及菌株，以备复验、谈判和仲裁。保存期满，需经灭菌后方可处理。11 菌株保存从检测样品中分离到并鉴定为草莓角斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株转接到WILBRINK-N或YPGA培养基斜面上，25.C恒温培养5d7 d。然后置于4.C冰箱中保存，定期(30d60 d)转接，防止病菌死亡;必要时将菌株用真空冷冻干燥机制成冻干粉，-80.C下长期保存。3 GB/
10、T 29429-2012 附录A(资料性附录)草莓角斑病菌的相关资料A.1 分布以色列、中国台湾、比利时、法国、希腊、意大利、葡萄牙、罗马尼亚、西班牙、瑞士、埃塞俄比亚、留尼旺、澳大利亚、新西兰、美国(加利福尼亚州、佛罗里达州、肯塔基州、明尼苏达州、威斯康星州)、阿根廷、巴西、智利、厄瓜多尔、乌拉圭、委内瑞拉。A.2 寄主范围草莓CFragariaananassa)是该病原菌的主要寄主。病原菌对草莓属CFragaria)的其他品种的致病性变化较大。人工接种情况下，弗州草莓CF.virginiana)、野草莓CF.vesca)、金露梅CPotentilla 斤uticosa)和委陵菜CP. gl
11、andulosa)均可被草莓角斑病菌侵染。草莓属植物中仅爵香草莓CF.moschata)对草莓角斑病菌免疫。A.3 生物学特性病叶残渣和带菌植株是发病的初次侵染源。在病残叶和土壤中，病菌能够存活到下茬作物;在实验室保存的干燥病叶片中，病原菌至少可存活两年半。在草莓开始生长时，病原菌由病残叶传播到幼叶上，细菌可从侵染区沿着幼叶基部叶脉扩散，在田间传播主要靠雨水、喷灌及风的作用传播。病原菌可通过气孔侵入，也可经过局部伤口或下方的病叶侵染，在整个生长期发生多个侵染循环，病菌可侵染植物的花，但不侵染果实。中等偏低的日温(大约20.C)、夜间低温及较高的湿度更有利于该病菌的侵染。4 、GB/T 2942
12、9-2012 附录B(资料性附录)草莓角斑病菌常用培养基、缓冲液配方B. 1 WILBRINK-N培养基蔚糖10.0g/L，蛋白陈5.0g/L，磷酸氢二饵0.5g/L，硫酸侯0.25g/L，硝酸铀0.25g/L，琼脂15.0 g/L,pH 7.20 B. 2 WILBRINK-N培养液蔚糖10.0g/L，蛋白陈5.0g/L，磷酸氢二拥0.5g/L，硫酸镜0.25g/L，硝酸铀0.25g/L, pH7. 2。B.3 YPGA培养基葡萄糖20.0g/L，蛋白陈10.0g/L，酵母膏5.0g/L，琼脂15.0g/L, pH 7.2。B.4 YPGA培养液葡萄糖20.0g/L，蛋白陈10.0g/L，酵
13、母膏5.0g/L, pH 7.2。B.5 PBS缓冲液氯化铀8.0g/L，氯化饵0.2g/L，磷酸氢二铀2.9g/L，磷酸氢二饵0.2g/L,pH 7.2 0 5 G/T 29429一2012C.1 革兰氏染色法附录C(规范性附录)生理生化测定按GB/T4789. 28-2003中2.2规定的方法进行。C.2 鞭毛染色法按GB/T4789. 28-2003中2.7规定的方法进行。C.3 草莓角斑病菌与近似种的区别草莓角斑病菌与近似种草莓细菌性叶斑病菌CX. arboricola pv. fragariae)及甘蓝黑腐病菌CX.ca m pestris)的区别见表C.l.表C.1 草莓角斑病菌与
14、草莓细菌性叶斑病菌及甘蓝黑腐病菌的区别测试项目草莓角斑病菌草莓细菌性叶斑病菌甘蓝黑腐病菌35 c生长ND + 2%NaCl生长十+ 水解七叶背+ + 明胶液化+ 十土蛋白消化ND + 淀粉水解十十士尿酶产生阿拉伯糖产酸ND + 半乳糖产酸+ + 海藻糖产酸ND + 纤维二糖产酸+ 十注:ND未测定;+90%以上菌株为阳性;一90%以上菌株为阴性;土11%-89%菌株为阳性。6 . 、飞h D.1 病原细菌DNA的提取附录D(规范性附录)PCR法检测GB/T 29429-2012 取待测样品或分离培养菌株，利用DNA提取试剂盒方法提取DNA，并测定DNA浓度，一20oC保存备用。也可直接用培养的
15、菌株稀释悬浊液作为模板进行PCR反应。D.2 引物序列正向引物:XF9: 5 -TGGGCCATGCCGGTGGAACTGTGTGG-3勺反向引物:XFll: 5 -TAC CCAGCCGTCGCAGACGACCGG-3 D.3 PCR反应体系及参数D. 3.1 PCR反应体系见表D.1.表D.1PCR反应体系试剂名称终浓度10XPCR反应缓冲液lX MgCl2 2.5 mmol/L dNTPs 0.2 mmol/L 正向引物0.2mol/L 反向引物0.2mol/L Taq DNA聚合酶2.5 U DNA模板1L 补H20至50L D.3.2 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照:以待
16、测健康的草莓叶片DNA为模板;阳性对照:采用草莓角斑病菌或含有待测基因序列的质粒;空白对照z设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照(以水代替样品)，二是PCR反应的空白对照(以水代替DNA模板)。D.3.3 PCR的反应参数95 oC/2 min;94 oC/30 s;65 oC/30 s;72 C /l min，35个循环。72oC/5 min，最后4oC保温。注:不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。NFON|N叮NH阁。GB/T 29429-2012 琼脂糖凝胶电谏制备2%的琼脂糖凝肢，用DNAMarker作为相对分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察并拍摄记录。D. 3. 4 结果判断D.4 侵权必究nv Fkd 吗nhv AU立-唱Baa-u赞nu F气FH唱AmE 号一价书一定版权专有若有537bp大小的产物带出现，可判定为阳性。16.00 j巳GB/T 29429-2012 打印日期:2013年4月18日F002
