1、道国ICS 65.020.01 B 16 和国国家标准11: -、中华人民GB/T 29431-2012 A.? 番茄溃殇病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. 2013-06-01实施发布中华人民共和国国家质量监督检验检蔑总局中国国家标准化管理委员会布一发一-一/川一AW/汀A-白4刑阳2-umr卢川 J GB/T 29431一2012目U本标准按照GBjT1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技
2、术委员会CSACjTC271)提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学、中国农业大学、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人:乐海洋、彭仁、刘琼光、罗来鑫、张建军、刘勇、冯欣、龚忠年、林友伟、张卫东、高文娜。I -4-t GB/T 29431-2012 番茄溃殇病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了番茄溃癌病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于番茄种子、苗木等相关茄科植物材料中番茄溃茄病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的
3、修改单)适用于本文件。SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样3 番茄溃痛病菌基本信息中文名z番茄溃癌病菌(密执安棒形杆菌密执安亚种)。学名:Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith, 1910) Davis et al. ，1984，简称Cmm)。异名:Corynebacteriummichiganense pV. michiganense(Smith) Dye &. Kemp;Corynebacterium m ichiganense (Smith) J ensen。病害英文名:Bacterial canker of
4、 tomato 0 属细菌域Bacteria、放线菌门Actinobacteria、放线菌纲Actinobacteria、放线菌目Actinomvcetales、微杆菌科Microbacteriaceae、棒形杆菌属Clavibacter。该病原菌的远距离传播主要靠带菌种子，番茄种子内外层都可带菌。在田间和温室，该病菌由伤口、气孔和自然孔口侵入寄主组织，主要通过灌溉水、雨水、修枝剪、培养料等传播。该病菌在土壤和病残体组织中可存活2年3年。番茄溃癌病菌的其他基本信息参见附录A。4 方法原理根据番茄溃癌病菌的危害状，对检疫现场或田间病害调查中发现的疑似病害症状样品进行采集并带回实验室作进一步分离鉴
5、定，依据病原菌的培养性状、致病性反应以及分子生物学特征对种类进行判定。5 仪器和用具生物显微镜、超净工作台、高压灭菌锅、光照恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平、低温冰箱、接种环、牙签、注射器、恒温水浴锅、高速冷冻离心机(12000 r/min以上)、匀浆机、PCR仪、电泳装置(电泳仪和水平电泳槽)、凝肢成像分析仪、微量可调加样器等。1 GB/T 29431-2012 6 主要试剂震糖、蛋白脏、酷蛋白水解物、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二饵(K2HP04)、磷酸二氢饵(KH2P04)、硫酸镜(MgS04 7H20)、琼脂、秦晓酣酸铀、硫酸多粘菌素、放线菌酣、棚酸(H2B03)、甘油、磷酸氢二铀(Na
6、2HP04)、吐温-20(Tween-20)、硫代硫酸铀(Na2S203)、氧化镀(NH4Cl)、Trizma碱、烟酸、亚暗酸饵、甘露糖、碳酸钙(CaC03)、乙二腊四乙酸(EDTA)、三是甲基氨基甲皖(Tris)、十二皖基磺酸铀(SDS)、液氮、三氯甲皖、异戊醇、异丙醇、琼脂糖(电泳用)、TaqDNA聚合酶、DNAMarker. 或5000粒左右，最少不低于3000粒种子生长环境温度24. 34 .相对湿度大于或等于70%.种子/、J出苗后15d内观察幼苗发病情况。如果种植期间有发病幼苗，且表现出番茄溃癌病苗期的典型症状(参见附录A).则避一抵制疑病株进行分离鉴定。/ 7.3 分离培辑 /
7、/ 7.3. 1 种子崎原组菌的分离踹/ / / 7.3. 1. 1 种子细菌漫捶渣制备/ 气/子提取缓冲液哦1g步步加何提取缓冲液比?养过夜(最茨坦h)在匀浆机上至少浸7min。分离培养番茄!弱病菌研用|可录B。、气 /多/7.3.1.2 半选择性培养基平板分篱严-用三层消毒纱布(或过滤袋)过滤种子浸提液，至少取2mL过滤提取液.8000g离心15 min.仔细除去上清液，沉淀用十分之一离心体积的元菌种子提取液悬浮，并用无菌种子提取液进行10倍梯度稀释(稀释到100倍).取0.1mL每一稀释度分别涂布于D2ANX和SCM或mSCM半选择性培养基平板。同时，用元菌种子提取缓冲液制备Cmm标准菌
8、株10倍系列稀释液，取0.1mL Cmm标准菌株的每一个稀释浓度分别涂布于上述半选择性培养基平板上，以保证至少一个平板菌落数在50200个范围内。将培养皿于26.C28 .C培养，在5d, 7 d, 10 d各检查平板菌落生长情况。检查Cmm标准菌株在两种培养基上生长情况和菌落形态特征。检查待测样品培养皿中是否有Cmm可疑菌落，与Cmm标准菌株比较。记录可疑菌落和其他菌落数。在D2ANX上培养5d7d后，Cmm菌落黄色，蒙古液状，凸起。在SCM上培养10d后.Cmm菌落灰白半透明，蒙古液状，最后为不规则型，中间内部有黑点(斑)。在mSCM上培养10d后.Cmm菌落半透明米白，蒙古液状，最后为不
9、规则型，中间内部带有黄色/橙色点(斑)。GB/T 29431-2012 菌落的大小和颜色在不同样品中可能存在差异。通常Cmm的形态和颜色在SCM和mSCM会发生变化。如果存在菌落形态和颜色的变化，每批样品每个皿至少挑取5个可疑菌落在YDC培养基上做进一步纯化培养观察。在YDC上，Cmm菌落黄色，圆形，凸起，蒙古液状，挑取具有这些特征的菌落，做进一步的番茄致病性测定。注意在YDC上划线过程中，若菌落未分开，其菌落形态不一定总是圆形的，如果存在这种情况，可挑取这些可疑菌落先进行紫莱莉(Mirabilisjalapa)接种检测，若测定为阳性，则进一步在番茄上进行致病性测定，若测定为阴性，则表明为非C
10、mm细菌。7.3.2 病组织中病原细菌的分离培养用灭菌剪刀剪取病变组织(叶片、茎轩、果实)上的病斑，在70%酒精或含有效氯7%的次氯酸铀溶液中表面消毒50560 5，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养皿中，加510滴元菌水，用灭菌慑子和剪刀将病组织捣碎，静置5min10 min，即制成组织液。用灭菌的接种环蘸一环组织液，在SCM或mSCM培养基上划线，每处理重复3次，25.C28 c下培养。Cmm在SCM或mSCM培养基上生长较慢，在25c 28 .C下需培养7d10 d才可见典型浅黄色菌落;纯化或活化Cmm则用YDC培养基为好，24h48 h内就可见典型金黄色菌落。挑取典型菌落，做进一步的
11、番茄致病性测定。如果存在与典型菌落有相似特征的可疑菌落，可挑取这些可疑菌落先进行紫莱莉接种检测，如果测定为阳性，则进一步在番茄上进行致病性测定，如果测定为阴性，则表明为非Cmm细菌。7.4 紫莱莉接种检测供测试的菌株在YDC琼脂斜面上培养48h后，用无菌水洗下，调整悬浮液中细菌的浓度为1 X 107 CFUjmL.用一次性注射器注射接种紫莱莉叶片，同时接种标准菌株做阳性对照，接种元菌水为阴性对照。接种后植株置于18.C 36 .C环境下36h48 h，观察过敏性坏死现象。当用Cmm接种后，紫莱莉的叶片在36h48 h内就能出现典型的过敏性坏死斑。其他棒状杆菌及常见植物病原细菌均不能引起紫莱莉产
12、生过敏性坏死反应。7.5 番茄上致病性测定感病番茄幼苗(如华南红宝石、佳粉10号、合作908等在生长环境温度25.C32 .C，相对湿度二三70%条件下生长到23片真叶(大约播种后3周4周)，用灭菌牙签蘸取YDC平板上可疑菌落，在番茄幼苗的子叶和第一片真叶之间茎的位置，穿剌法接种。同时接种标准菌株做阳性对照，元菌牙签蘸取无菌水接种做阴性对照。接种后植株置于25.C 32 .C条件至少8h光照培养，并适时浇水保持苗床土壤湿润。接种后2周3周，观察植株的萎藩症状，与阳性对照进行比较并做好相关记录。由Cmm引起的典型症状是在接种位置产生溃癌斑，变黄，边缘坏死，真叶萎焉。7.6 分子生物学检测在上述检
13、测和鉴定的基础上，可通过分子生物学检测进一步确定和验证。从分离培养的细菌菌株中提取DNA(也可直接用菌液，浓度1X 105 CFUjmL)，或从表现典型症状的病组织中提取DNA，作为模板，进行PCR检测和电泳分析。用Cmm标准菌株DNA作为阳性对照，用非Cmm的植物病原细菌DNA作为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行PCR扩增。具体检测方法见附录C。8 结果判定若经症状检验并分离的细菌菌株在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符，致病性测定表现典型症状，且PCR检测结果为阳胜，扩增的片段大小与描述相符，则可以判定为检出Cmm.其余情况判定为未检出Cmm.3 GB/T 29431-2012 样晶保
14、存保存样品经登记和经手人签字后置于阴凉干燥、防虫防鼠处妥善保存3个月。对检出番茄溃痛病菌的样品应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁，该类样品保存期满后，需经灭菌后方可处理。9 菌株保存10 / / / / 、/ 飞飞-飞气/ 4 GB/T 29431-2012 附录A(资料性附录)番茄渍痛病菌(Cmm)其他信息A.1 地理分布亚洲:中国、印度、伊朗、以色列、日本、黎巴嫩;非洲z埃及、肯尼亚、摩洛哥、南非、多哥、突尼斯、乌干达、赞比亚、津巴布韦;欧洲z土耳其、奥地利、比利时、保加利亚芬兰、法国、德国、希腊、匈牙利、爱尔兰、意利亚A. 手Lnu vulgare)、黑麦($ecalecereale
15、)、燕麦二ena二pp.)、向自葵(自EUtus)、黄瓜(Cucumissat句ls)、辣椒Casicumarznuum)、茄子(5A.4 生物学特性病原细菌短杆状或棒杆状，革兰氏染色阳性，无芽抱，无鞭毛，严格好氧。大小为(0.3m0.4m)X(0.6m1.2m)，在523培养基(见附录B)上28.C培养，菌落黄色、圆形、略突起、边缘整齐、光滑不透明、蒙古稠状，直径2mm3 mm。在YDC上，Cmm菌落黄色，凸起，蒙古液状。接种烟草和紫莱莉可产生过敏性坏死反应。硝酸盐还原阴性，尿酶阴性，明胶液化慢，水解七叶昔，水解淀粉能力很弱或不水解。生长需要氨基酸、生物素、烟酸和硫胶素。最高能忍耐4%的盐度
16、，能利用葡萄糖、煎糖、阿拉伯糖、甘露糖、麦芽糖和甘油，不能利用鼠李糖、棉子糖、松三糖、甘露醇、山梨醇。能利用苯甲酸、拧攘酸、延胡索酸、丁二酸和苹果酸，不能利用甲酸、丙二酸、草酸、酒石酸、丙酸及半乳糖酸。液化明肢，不产生呵|噪，但产生H2S，不还原硝酸盐，石藤牛乳还原不产生氨。尿酶、苯丙酸脱氨酶、氧化酶、色氨酸脱氨酶阴性，过氧化氢酶为阳性。5 GB/T 29431-2012 附录B(规范性附录)番茄渍癌病菌(Cmm)常用培养基、缓冲灌配方B.1 种子提取缓冲液(pH7.4) Na2 HP04 7.75 g;KH2P04 1. 65 g;Tween-20 0.2 mL;Na2S203 0.5 g(
17、当种子已经用次氯酸盐处理后推荐使用);蒸锚水1000mL，pH值调至7.4，121.C高压灭菌15min。B.2 D2ANX培养基酵母膏2.0g;酷蛋白水解物4.0g;葡萄糖10.0g;MgS04 7H20 O. 3 g;NH4Cl 1. 0 g;Trizma碱1. 2 g;琼脂18g;蒸馆水1000mL,121 .C高压灭菌15min后，冷却至50.C时加入2.8mL荼睫酣酸铀(10 mg/mL，溶解于O.1 mol/L NaOH中)，0.5mL放线菌酣(200mg/mL，溶解于纯甲醇中)，1mL硫酸多粘菌素。omg/mL，溶解于蒸锢水中)。B.3 SCM培养基酵母膏0.1g;震糖10.0g
18、;H3B03(棚酸)1.5 g;MgS04 7H20 0.25 g;K2HP04 2.0 g;KH2P04 1. 5 g;琼脂18g;亚暗酸饵10mg;蒸锢水1000 mL, 121 .C高压灭菌15min后，冷却至50.C时加入3 mL荼睫酣酸铀(10mg/mL，榕解于O.1 mol!L NaOH中)，1mL放线菌酣(200mg/mL，溶解于纯甲醇中)，5mL烟酸(20mg/mL，需解于蒸锢水中)。B.4 mSCM培养基酵母膏O.1 g;甘露糖10.0 g; H3B03 (副酸)1. 5 g; MgS04 7H20 0.25 g; K2HP04 2.0 g; KH2P04 1. 5 g;琼脂
19、18g;蒸馆水1000 mL,121 .C高压灭菌15min后，冷却至50.C时加入3mL荼睫酣酸铀(10mg/mL，溶解于O.1 mol/L NaOH中)，1mL放线菌酣(200mg/mL，溶解于纯甲醇中), 5 mL烟酸(20mg/mL，溶解于蒸锚水中。B.5 YDC(酵母浸膏-葡萄糖碳酸钙)培养基酵母浸膏10.0g;D-葡萄糖20.0g; CaC03超微粉Clightpowder) 20. 0 g;琼脂18.0g;蒸锢水1 000 mL, 121 c高压灭菌15min. B.6 523培养基(pH7. O-pH 7. 1) 蛋白陈8g;酵母粉4g; MgS04 7H20 O. 3 g;蔚
20、糖10g;磷酸氢二饵2g;琼脂18g;蒸馆水1 000 mL，pH值调至7.07.1，121 c高压灭菌15min。6 GB/T 29431-2012 附录C(规范性附录)番茄渍痛病菌(Cmm)PCR检测方法C. 1 试剂及配制C. 1. 1 DNA抽提液配方100 mmol/L Tris-HCl,pH 8:/0/ 250 mmol/L NaCl /石/J r C巳.1口2C旧沉淀翻制t亢二rl%CTAB( 量浓度)(十六皖基三乙基澳化镀50 mmol/i Tr:Cl，pH 8.0 10 mr口叫IC. 1. 3 TE援冲液配方10 mrnol/L Tris-HCl,pH 8.0 1 mntl
21、/L EDTA，卢8.0C. 1. 4 TAE电旅缓冲撞GH8叫方 C.2 样晶DNA提取C. 2.1 病组织中总DNA提取币子jiv 飞 ZL町12LZ将待检测的新鲜病组织约0.2g用剪刀剪碎，置于灭菌研钵中，加入适量液氮，迅速研磨，成粉状。然后将其转移至1.5 mL离心管中，加入1.2 mL DNA抽提缓冲液(含2%萨就基乙醇)，充分?昆匀，65 .C水浴中孵育30min.室温12000 r/min离心10min，取上清液700L移至另一1.5 mL离心管中，加入5LRnase A(10g/mL) ,37 .C水洛孵育30mino加人等体积的三氯甲烧-异戊醇(24: 1), 颠倒混匀。室温
22、12000 r/min离心10min，取上清液600L移至另一1.5 mL离心管中，加入等体积CTAB沉淀液，混匀，室温12000 r/min离心10min，弃上清液。加入600L氯化铀(1.2 mol/L)室温静置5min，加入等体积的三氯甲烧-异戊醇(24:1)，颠倒混匀。室温12000 r/min离心10min，取上清液600L移至另一1.5 mL离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置30min. GB/T 29431-2012 12 000 r/min离心10min，弃上清液。用70%冷乙晖洗涤沉淀两次，元水乙醇洗涤沉淀一次，踪干。加人50LTE缓冲液溶解DNA沉淀。一20
23、c长期保存。C.2.2 病原细菌DNA的提取将供试菌株在523斜面培养基上培养48h(28 C)。在每一试管中加人0.1mol/L磷酸铀缓冲液10 mL洗下菌苔。将细菌悬浮液转移至一干净的12mL离心管中，12000 r/min离心15min，弃上清液。在沉淀中加入TE缓冲液5mL，10%SDS榕液300L，20mg/mL蛋白酶K30L，混匀，37c水浴孵育1h。加入等体积的三氯甲:皖-异戊醇(24: 1)，混匀。10000r/min离心5min，将上清液移至一个新管中。加入等体积的酷-三氯甲烧-异戊醇(25:24:1)，混匀，10000 r/min离心5min，将上清液移至一个新管中。加人0
24、.6倍体积的异丙醇，轻轻混合至DNA沉淀，10000 r/min离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，晾干，加入50LTE缓冲液溶解DNA沉淀，一20c长期保存。注:此步也可省略。可直接用培养的菌株稀释成10SCFU/mL的菌悬液作模板进行PCR检测。C.3 PCR检测C. 3.1 PCR反应体系C. 3. 1. 1 检测Cmm采用的PCR引物序列见表C.1.表C.1检测Cmm的PCR引物序列引物名称引物序列PCR产物大小bp Spm4f 正向引物:5 -TCAGGCGTCTGTTCTGGC-3 223 Spm2r 反向引物:5 -CCCACCACCA TCCACAAC-3 C. 3.
25、1.2 检测Cmm采用的PCR反应体系见表C.2。表C.2检测Cmm的PCR反应体系组成加样体积L 10XPCR缓冲液(含MgC12浓度为15mmol/L) 2.5 dNTP(各2.5mmol/L) 2 Taq DNA聚合酶(2.5U/L) 0.4 正向引物(10pmol/ I-L) 1 反向引物(10pmol/I-L) 1 模板DNA(1ng/L-10 ng/L) 1 双蒸水17.1 总体积25 C. 3. 2 PCR反应循环参数检测Cmm采用的PCR反应条件为:94 c预变性5min;随后94C , 30 s, 60 C , 40 s , 72 C , 1 min，进行35个循环F最后72
26、c延伸8 GB/T 29431-2012 7 min，并置于4C保温。上述PCR反应用Cmm标准菌株DNA作为阳性对照，用非Cmm的植物病原细菌DNA作为阴性对照，用双蒸水作空白对照。C. 3. 3 PCR扩增产物的检测用TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝肢，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，将混有上样缓冲液的PCR扩增产物加样品孔中，用DNAMarker做相对分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录实验结果。且-gJe 9 NFON-的叮NH阁。华人民共和国家标准番茄溃痛病菌检症鉴定方法GB/T 29431-2012 国申4司* 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 开本880X 1230 1/16 印张1字数18千字2013年4月第一版2013年4月第一次印刷 书号:155066. 1-46464 18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107定价29431-2012 打印日期:2013年4月18日F002
