1、ICS 65.020.01 B 16 ，在.诅画.:_-_.明!.,!IIIIIT 一一一_，亏-h:_ r:. rX，;:.-:.I.飞_.飞. ，:-凰，f:一一一一一一一一一-三二、到.监_.击.怯.，:.四野:立.，:.，-_w. _ . 中华人民共和国国家标准GB/T 29589-2013 香菜腐烂病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Mycocentrospora acerina CHartig) Deighton 2013-07-19发布2013回12-06实施，.fJ4a警阳有p悦牛， )厅、UE,. .-.，.川3帽也幽曹W帽H;俨。
2、m阙ii.i剧目晖.苦。豫罩查明/中华人民共和国国家质量监督检验检菇总局俗世中国国家标准化管理委员会。叩GB/T 29589-2013 前本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本标准起草单位z中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、云南农业大学。本标准主要起草人z种巍、王英超、邵秀玲、赵汗青、庞国兴、江丽辉、李建勇、刘云国、高文娜、刘云龙、纪瑛、何永宏。I GB/T 29589-2013 香菜腐烂病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了香菜腐烂病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于香菜、胡
3、萝札元葱、杜鹊花等经济作物和观赏植物中香菜腐烂病菌的检疫和鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注目期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程SN/T 1809 进出境植物种子检疫规程3 香菜腐烂病菌基本信息中文名z香菜腐烂病菌。学名:Mycocentrospora acerina CHartig)Deighton, 1972。异名:Cercosoraacerina Hartig, 1880 I Cercospora ohlsenii Neergaa时，19
4、42;Ansatosora macro spore Newhall,1944. 病害英文名:caraway stem rot. 属于真菌界Fungi，半知菌亚门Deuteromycotina，丝抱纲Hyphomycetes，丝抱目Hyphomycetales，暗色菌科Dematiaceae，菌刺抱属Mycocentrospora。通过感病种子远距离传播。香菜腐烂病菌的其他信息参见附录A.4 方法原理经现场查验，实验室分离培养，根据病原菌的形态特征、生物学特性，结合寄主范围进行结果判定。5 仪器5. 1 生物显微镜(具抽镜镜头)、具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于50X)。5.2 超净工
5、作台。5.3 电子天平。5.4 光照恒温培养箱。5.5 酒精灯。5.6 高压灭菌器。5. 7 培养皿。5.8 医用注射器(10mL)及针头(18号)。1 GB/T 29589-2013 5.9 医用手术剪、慑子。5. 10 烧杯(500mL)。5. 11 试管(直径12mm)。5. 12 载玻片、盖玻片。5. 13 量筒(500mL)。5. 14 元色透明塑料袋。5. 15 血球计数器。6 主要试剂蒸馆水、PDA培养基、1%汰氯酸铀或70%乙醇。7 现场检测7. 1 抽样方法棋盘式、五点式或随机抽样。7.2 抽样数量7.2. 1 种子对来自香菜腐烂病菌发生国家和地区(参见附录A)的香菜、胡萝卡
6、、芹菜等植物种子按SN/T1809 进行抽样。7.2.2 整株植物或插枝对芹菜、胡萝卡、杜鹊花等经济作物和观赏植物按SN;T1157进行抽样。7.3 症状检查对芹菜、胡萝卡、杜酶花等经济作物和观赏植物或插枝，注意检查植株茎部上是否有腐烂和茎轩枯萎死亡等症状，对于种子观察是否有腐是等症状z收集上述可疑植韧材料等并带回实验室检验。8 实验童检测8. 1 分生于包子的直接镜栓观察对于有腐烂和茎轩枯萎死亡等症状的芹菜、胡萝扒杜鹊花等经济作物和观赏植物或插枝，以及有腐足等症状的种子，直接挑取症状上的霉状物镜检观察。单抱分离获得纯培养。8.2 种子上病菌的分离和纯化种子在1%次氯酸铀(有效浓度中浸泡10m
7、in，然后倒去多余的溶液。后用元菌水洗3.4次。每个培养皿中放三张9.0cm撞纸，并用无菌水浸透，倒去多余的水。在元菌条件下，在每个培养皿的滤纸上均句地摆放10.50粒种子，种子之间的距离最少应有20mm，间隔要均匀，一般每批次最少做400粒种子。20.C下.12h的黑暗与12h近紫外光照交替培养8d.10 d。培养皿在光管下约25cm处，不要重叠。用肉眼或在解剖镜下挑取可疑菌落，获得纯培养。GB/T 29589-2013 8.3 植株上病菌的分离和纯化选取可疑病斑，用1%次氯酸销或70%乙障表面消毒30s左右，用无菌解剖刀在样品病健交界处挑取2mmX2 mm病健交界组织若干块，将组织置于1%
8、次氯酸销或70%乙醇处理的元菌平皿中5 min10 min，移人元菌水中洗三次，最后放置于PDA培养基(直径:7.5 cm)平板上，每平板放置5点，重复放置三块平板，20.C25 .C下培养2d4 d后用灭菌挑针挑取组织块边缘的菌丝，将其转移至PDA上纯化3次获得纯培养。8.4 病原鉴定8. 1、8.2和8.3获得的纯培养，在温度为20c、室内光照条件下培养病原菌，观察其菌落形态、颜色、色素，采用菌块切割保湿培养方法(见即录助诱导分生抱子产生，观测其于缸子大小、着生方式以及附属丝的有元，综合以上进行鉴定。8.5 致病性测定按照附录B的方法进行接种试验。9 鉴定特征9. 1 形态特征9. 1.
9、1 镜栓现寨将有症状病斑的种子和植株放在显微镜下观察分生班子和分生抱子梗:分生于包子梗短菌丝状，上部屈膝状，并具有宽而平的抱痕，淡色，通常不分枝，多元隔膜，少数具有12个隔膜，单生或35根丛生，(18m65m)X(4mlOm)。分生抱子单生、顶侧生，倒棍棒形，具长朦，长嗦基部平截，淡褐色，(49m-260m)X(6m15m) ，424个隔膜，隔膜处微突起参见附录。少数抱子具有一个从基部细胞侧生出的剌状附属丝，(25m150m)X(2m3m)。未发现有性阶段。9. 1. 2 培养观察在PDA培养基上培养，菌丝宽4m7m，后期菌丝胞壁加厚，形成念珠状串生的褐色厚垣抱子，厚垣抱子长椭圆形或矩圃形，(
10、15m30pm) x (15m，.，20m)o在人工培养基上不易产生分生抱子，采用菌块切割保湿培养方法可获得分生抱子。9.2 培养特征在PDA培养基上培养，在全黑暗的条件下菌丝的生长速度最快，其颜色最初呈白色，以后逐渐变成黑色，无玫瑰红色素的产生。光照条件下菌落初期无色，48h后变为紫红色或玫瑰红色，色素可扩散到基质里，随菌龄增长菌落中央变为灰色直至最后变为黑色。9.3 致病性测定9.3. 1 番茄症状z病斑初期水渍状，后变为浅褐色，病斑近圆形，随后病斑合并腐烂。叶柄和枝柄受害呈暗揭色水渍状锺缩，病斑长梭形，脱落F茎轩受害后病斑变揭折垂。病斑表面生稀疏白色霉层。9.3.2 胡萝卡接种症状z初期
11、水渍状，后变为洗褐色，最后变为黑色。9.3.3 致病菌的再分离和鉴定z用接种发病的叶片作常规病组织分离，获得的分离菌与原接种菌形态特征相同。镜检观察在患病组织上可产生较多的分生抱子，特征与8.1描述的特征一致。3 GB/T 29589-2013 10 结果判定如现场检疫症状、分离物的形态特征、培养特征、致病性特征及再分离菌株的形态特征与7.3、第9章所述鉴定特征吻合，可判定为香莱腐烂病菌。11 菌种的保存分离并最终鉴定为香菜腐烂病菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4C左右冰箱中保存，并定期(30d-60 d)转管，防止因斜面干燥而造成病原菌死亡。菌株至少需保存6个月，保存期满
12、后，需经灭菌处理。4 GB/T 29589-2013 附录A(资料性附录)香莱腐烂病菌相关资料A.1 致病性在低温高湿条件下引起蔬菜和观赏植物病害，如胡萝卡根腐病、芹菜冠腐病、欧防风溃痛病、报春花根腐病等。A.2 地理分布A.2.1 亚洲2日本、印度尼西亚、中国(辽宁省新宾县、清原县、凤城县、桓仁县、本漠县和云南省文山州)。A.2.2 欧洲z法国、丹麦、荷兰、挪威、英国、德国、奥地利、保加利亚、捷克。A.2.3 大津洲t澳大利亚、新西兰。A.2.4 北美洲z美国、加拿大。A.3 寄主范围香菜腐烂病菌的寄主范围相当广泛，寄主植物已达25科50属61种，其中自然感病寄主16科27属32种。涉及经济
13、价值较高的经济作物和观赏植物有z伞形科中的胡萝卡(Daucuscarrot)、芹菜(Apium graveolens)、欧防风(Pastinacasativ川、香菜(H erba Coriandri)，百合科的洋葱(Alliumcea)，茄科的番茄(Lycopersicon esculentum) ，豆科的莱豆(Phaseolusvulgaris)，葱科的甜菜(Betavulgaris) ，十字花科的花椰菜(Brassicaoleracea)，菊科的离宦(Lactvcasaiva)、矢车菊(Centaureacya nus)、翠菊(Callistephuschinensis) ，秋海棠科的四季
14、海棠(Begoniasempe矿lorens)，报春花科的报春花(Primula malacoides)、仙客来(Cyclamenersicum) ，天堂葵(Pelargoniumgraveolens)，杜鹊花(Rhododendron simsii)，扉香石竹(Dianthuscaryophyllus)，三色紫罗兰(Matthiolaincana) ，德国莺尾(lris germanica) ，钓钟柳(Penstemonbarbatus)，紫盆花(Scabiosaatropururea) ，风铃草(Camanulamedium) ，辽细辛(Asarumheterotrooides var.
15、mandshuricum)，汉城细辛(Asarumsieboldii var. seoulense) ，三七(Panaxnotoginseng)。此外该菌还可寄生于人的面部和胞囊线虫卵内。A.4 生物学特征香菜腐烂病菌是一种在低温高湿条件下易于侵染的病原菌，侵染的最低温度为亚冰点温度(一0.7C)，最高30C，最适温度为15C -20 c。菌丝生长最适温度为17C，pH范围为4-10，最适6.50直射光、散射光和灯光均可产生色素，菌丝产生的色素与光照时间以及强度成正比。A.5 传播方式香菜腐烂病菌是一种土传病害，其厚垣抱子具较强抗逆性，能够在土壤中至少存活2年，是该菌主要的侵染源。分生抱子和菌
16、丝也可在病残体上越冬，成为发病的初侵染源。伤口;是该病菌侵染的主要途径。5 GB/T 29589-2013 附录B(规范性附录)香菜腐烂病菌致病性测定方法及步骤B. 1 接种物的准备用无菌水收集在PDA平板培养7d的菌落上的厚垣抱子，或采用菌块切割保湿培养方法获得分生抱子，并配成105 106个/mL以上的抱子悬浮液.或者取在PDA平板上培养4d5d的菌落边缘的菌丝块做接种菌丝。B.2 菌块切割保湿培养法将培养7d的菌落用0.5cm的打孔器将其切割成菌块，置于放有无菌水和滤纸的培养皿中，18c 光照培养，诱导分生抱子产生。B.3 接种方法采用致伤接种方法接种番茄叶片或胡萝卡块茎或其他寄主植物。
17、喷雾抱子悬浮液接种，或菌丝接种(用元菌水保湿)。用抱子或菌丝接种的，均喷元菌水或无菌培养基于刺伤部位作为对照。供试寄主或离体叶片或胡萝卡在20c、明暗交替各12h条件下保湿48h后观察叶片或胡萝卡发病症状。6 附录C(资料性附录)香菜腐烂病菌形态特征圄香菜腐烂病菌形态特征见图C.L说明=A一-厚垣袍子sB一一分生抱子梗zC一一分生袍子和基部侧生的刺状附属丝。注z仿EllisM B. 1976. 圄C.1香莱腐烂病菌形态特征圄GB/T 29589-2013 的FON|mmNH阁。华人民共和国家标准香菜腐烂病菌栓擅鉴定方法GB/T 29589-2013 国中 中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号。0004日网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销祷印张O.75 字数16千字2013年10月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2013年10月第一版* 书号:155066.1-47529定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 29589-2013 打印日期:2013年10月21日F002
