1、安 徽 省 地 方 标 准 杂交水稻及其亲本种子检验规程 真实性和品种纯度的基因指纹鉴定法 Rules for hybrid and its parents in rice testing Molecular identification of genuineness and purity DB34/T196-1999 1 范围 本标准规定了用基因指纹鉴定种子真实性和品种纯度方法中的定义、原理、仪器、试剂和溶液、程序、结果计算以及结果报告。 本标准适用于杂交水稻及其亲本种子真实性和品种纯度的检测。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版
2、本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨、使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T3543.2-1995 农作物种子检验规程 扦样 GB/T3543.5-1995 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 3 定义 本标准采用下列定义。 水稻基因指纹 某一品种 DNA 结构和组成的特征。 4 原理 品种的不同是由于其遗传物质DNA组成和结构不同而致，因此， 可以利用RAPD （Random Amplified Polymorphic DNA）分子标记技术，对不同杂交水稻组合及其亲本进行 PCR（Polymerase Chain Reaction）扩增反应，从中筛选出能够区别不同杂
3、交水稻组合及其亲本的多态性 DNA 片段。在比较分析的基础上，将那些具有基因型特异性的 DNA 片段进行克隆、测序，借助计算机软件设计并合成特异性标志引物。利用这些标志引物，同受检材料进行稳定的特异性序列扩增，根据有无标记带的出现，从而达到快速、准确地鉴定杂交水稻组合及其亲本的目的。 5 仪器 a)PCR 扩增仪。 b)高速冷冻离心机，转速为 10000rpm 以上。 c)电泳仪，满足稳压 500v 以上。 d)紫外光透射仪。 e)微量进样器和与之配套的吸头，规格为 20l、100l、1ml。 f)重蒸水蒸馏器。 g)冰箱，低温（-20以下）和普通型。 h)照像机，带紫外光滤光片。 i)高压灭
4、菌锅。 j)量筒，规格为 50ml、100ml、500ml。 安徽省技术监督局 1999-12-30 发布 2000-01-01 实施 DB34/T091-1993 k)薄壁 PCR 扩增管，规格为 0.2ml。 l)Eppendorf 离心管，规格为 1.5ml。 m)天平，感量为 0.1g。 6 试剂和溶液 6.1 试剂 试剂等级要求为化学纯或化学纯以上。 a)三羟甲基氨基甲烷（Tris） b)乙二胺四乙酸钠（EDTA） c)氯化钠（Nacl） d)十二烷基磺酸钠（SDS） e)异丙醇 f)乙醇 g)4 种脱氧核苷酸（dNTP ） h)Taq DNA 聚合酶 i)标准分子量标记 j)特异性
5、引物 k)琼脂糖 l)溴化乙锭 m)溴酚蓝 n)蔗糖 o)乙酸 p)重蒸馏水 6.2 溶液 a)DNA 提取液 100mmol/LTrisHCL ， 20mmol/LEDTA（pH8.0）， 500mmol/LNacl， 1.5%SDS，高压灭菌后，在（4 2 ）的环境下保存。 b)凝胶缓冲液和电泳缓冲液 40mmol/LTrisHCL ，1mmol/L EDTA （pH8.0 ），高压灭菌后在（4 2 ）的环境下保存。 c)6 倍的凝胶加样缓冲液 0.25%溴酚蓝，40% （W/V ）蔗糖水溶液，在（4 2）的环境下保存。 d)溴化乙锭荧光染色液 称取 1.0g 溴化乙锭溶于 100ml 水
6、中，磁力搅拌至完全溶解，然后转移至棕色瓶中，在（4 2 ）的环境下保存。 e)10 倍反应缓冲液 500mmol/L KCL， 100mmol/L TrisHCL （ pH8.0）， 25mmol/L Mgcl2， 0.1%（W/V ）明胶。 7 程序 7.1 取样 DB34/T091-1993 检验样品的扦样，分样和保存，按 GB/T3543.2 的规定执行。 检验样品的重量为 500g，试验样品的数量为 400 粒，若仅作真实性鉴定则检验数量为 50 粒。 7.2 样品 DNA 提取 a)取单粒受检种子粉碎至粉末状，装入 1.5ml 的离心管中。 b)加 600l DNA 提取液，50条件
7、下水浴 1h，在此期间，振荡 2 次-3 次。 c)在 10000rpm、 4的条件下离心 10min，将上清液转移至另一只 1.5ml 离心管中，加入等体积异丙醇混匀，室温静置片刻。 d)离心 10min（条件同上），弃上清液，将沉淀物用 200l 的 70%乙醇洗涤，再离心 10min（条件同上），重复洗涤两次。 e)将沉淀物置常温下 30-60 分钟后，溶于 20l 重蒸馏水中。 7.3 PCR 扩增反应 7.3.1 扩增反应方法 用 PCR 特异性引物（根据鉴别的杂交水稻组合及其亲本的不同而选择适宜的引物，引物选择见（附录 A）同受检种子的基因组 DNA 进行 PCR 扩增反应。 7.
8、3.2 扩增反应条件 每 35l 反应体积中包括 0.1mmol/L 的 dNTP 混合物， 正向和反向引物各 0.2mmol/L， 2lTaqDNA聚合酶和 2l 提取物（含 50ng 左右的水稻基因组 DNA） ，加 3.5l10 倍反应缓冲液，最终用重蒸馏水定容至 35l，在 PCR 扩增仪上进行扩增。 7.3.3 扩增反应程序 94 5min 变性后，按 94 1min、55 1min、72 2min 的设置进行 35 个循环，循环结束后在 72下延伸 5min。 7.4 琼脂糖凝胶制备 称取 1.2g 琼脂糖，加 100ml 凝胶缓冲液，加热完全熔化琼脂糖待冷却到 50-60 后，加
9、入 1l 溴化乙锭摇匀后倒入两端用胶带封好的凝胶板中，插入样品梳。 7.5 进样 待琼脂糖凝胶完全凝固后，小心拔出样品梳，将凝胶连同胶板一起放入电泳槽中，注入一定的电泳缓冲液使基没过凝胶，用微量进样器吸取 2l-10l 样品和 1l-2l 6 倍的加样缓冲液混匀后，再加入到样品孔中。 7.6 电泳 在靠近加样孔一端的电极接上负极，另一端接上正极。一打开电源，稳压在 90V，电 泳 0.5h-1.5h左右，具体时间可按溴酚蓝迁移距凝胶边缘 1cm-2cm 来定。 7.7 鉴定 关闭电源，将凝胶连同胶板小心地取出，在紫外光下观察电泳条带，并拍照记录。 在紫外光下观察，若出现特征性的条带即表明鉴定的
10、材料是同标准样品一样的品种；若无特征性条带，即表明受检材料是与标准样品不同的品种，从而达到鉴定种子真实性以及测定品种纯度的目的。 8 结果计算 DB34/T091-1993 纯度检验结果按式（1 ）计算 供检测的种子粒数无特征性条带的种子粒数 品种纯度（% ）= 100（1 ） 供检测的种子粒数 9 结果报告 按 GB/T3543.5 规定执行。 附录A（提示的附录） 不同水稻的杂交种及亲本对应引物的设计与选择 引物编号 碱基组成 用 途 RSP01正向：23bp 反向：23bp 鉴定协优 64 RSP02正向：25bp 反向：28bp 鉴定珍汕 97B RSP03正向：24bp 反向：24bp 鉴定汕优 97A RSP04正向：24bp 反向：23bp 鉴定汕优 63 RSP05正向：22bp 反向：23bp 鉴定明恢 63 RSP06正向：25bp 反向：27bp 鉴定协青早 A RSP07正向：24bp 反向：22bp 鉴定协青早 B RSP08正向：25bp 反向：25bp 鉴定协优 63 RSP09正向：24bp 反向：26bp 鉴定汕优 64 RSP10正向：25bp 反向：25bp 鉴定测 64 RSP11正向：23bp 反向：23bp 鉴定汕优晚 3 RSP12正向：27bp 反向：25bp 鉴定晚 3
