1、ICSl306050Z 16中华人民共和国水利S L行业标准水质粪大肠菌群的测定多管发酵法Water qualityDetermination of multitubezymotechnique fecal coliform group20070202发布 20070502实施中华人民共和国水利部发布中华人民共和国水利部关于批准发布水利行业标准的公告2007年第l号中华人民共和国水利部批准以下12项标准为水利行业标准，现予以公布。二oo七年二月二日I序号 标准名称 标准编号 替代标准号 发布日期 实施11期1 沙棘原果汁 SL 353-2006 20070202 200705022 水质初级生
2、产力测定“黑白瓶”测定法 SL 354 2006 20070202 200705023 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法 SL 355-2006 20070202 200705024 水泵模型及装置模型验收试验规程 SL 140-2006 SLl40 97 20070202 200705025 小型水电站建设项目建议书编制规程 SL 3562006 20070202 200705026 农村水电站可行性研究报告编制规程 SL 3572006 20070202 200705，027 农村水电站施工环境保护导则 SL 358-2006 20070202 200705028 水利水电工程环境保护概估算
3、编制规程 SL 359-2006 20070202 200705029 地下水监测站建设技术规范 SL 360一-2006 20070202 2007050210 大坝观测仪器位移计 SL 3612006 20070202 2007050211 大坝观测仪器测斜仪 SI。362 2006 20070202 200705。0212 大坝观测仪器锚杆测力计 SI。363-2006 2007 0202 20070502目 次前言1范围2方法原理3试验条件与环境4仪器设备5培养基6革兰氏染色试剂7试验步骤8结果计算9注意事项一SL 3552006-1-1-一1-1-“1-2-”3-4-4SL 3552
4、006刖 吾本标准是根据中华人民共和国水利部技术标准编制工作计划安排进行制定的。本标准的体例格式遵循GBT 112000标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则的规定。本标准的主要内容包括：范围、方法原理、试验条件与环境、仪器设备、培养基、革兰氏染色试剂、试验步骤、结果计算及注意事项。本标准批准部门：中华人民共和国水利部。本标准由水利部水文局提出并归口。本标准主持机构：水利部水文局。本标准解释单位：水利部水文局。本标准主编单位：北京市水文总站。本标准出版、发行单位：中国水利水电出版社。本标准主要起草人：秦斌、王建厅、高俊杰、冯伶亲、武佃卫。本标准审查会议技术负责人：齐文启。本标准体例格式审
5、查人：曹阳。水质 粪大肠菌群的测定多管发酵法SL 35520061范围本标准规定了水中粪大肠菌群的多管发酵测定方法。本标准适用于地表水、地下水、生活饮用水等，特别是浑浊度高的水中粪大肠菌群的测定。2方法原理用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开。在445C仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群。3试验条件与环境试验环境应符合实验室生物安全通用要求(GB 19489 2004)要求，试验过程要在无菌条件下进行。4仪器设备41显微镜42高压蒸汽灭菌器43干热灭菌箱44恒温培养箱(37-+l oC)45恒温培养箱(445。C-+02)46玻璃器皿(需置于干热灭菌箱中，160灭
6、菌2h)包括：试管、平皿(9cm)、锥形瓶、刻度吸管、倒管等。47接种针、载玻片等48酒精灯49紫外灭菌灯410 pH计5培养基51乳糖蛋白胨培养液511成分蛋白胨：109牛肉膏：39乳糖：59氯化钠：5916溴甲酚紫乙醇溶液：1mL蒸馏水：1000mL512制备方法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000mL蒸馏水中加热溶解，pH值调整为7274，再加入lmL 16溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中，115(2灭菌20min，储存于冷暗处备用。1SL 355200652浓乳糖蛋白胨培养液按51中乳糖蛋白胨培养液组成，蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠的3倍用量
7、配制。53 EC培养液531成分胰蛋白胨：209乳糖：593号胆盐或混合胆盐：159磷酸氢二钾：49磷酸二氢钾：159氯化钠：59蒸馏水：1000mL532制备方法将531中各成分加热溶解于蒸馏水中，pH值调整为6902，然后分装于带有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器，115高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。54伊红美蓝琼脂培养基541成分蛋白胨：109乳糖：109磷酸氢二钾：29琼脂：20309 蒸馏水：1000mL2伊红水溶液：20mL05美蓝水溶液：13mL542储备培养基的制备先将琼脂加至900mL蒸馏水，加热溶解，然后加人磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000m
8、L，pH值调整为7274。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于锥形瓶内，置高压蒸汽灭菌器中，115 0C灭菌20min，储存于冷暗处备用。543平皿培养基的配制将按542制备的储备培养基加热融化，无菌操作，根据锥形瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取已灭菌的2伊红水溶液和05美蓝水溶液，加入已融化的储备培养基内，并充分混匀防止产生气泡)，待其冷却至445C后立即将此种培养基适量倾人于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置于冰箱内备用。6革兰氏染色试剂61染色液结晶紫溶液：结晶紫乙醇饱和溶液(取结晶紫约489，溶于95乙醇100mL中)20mL，1草酸铵溶液80mL，将
9、两种溶液混合，过滤。62助染剂碘：19碘化钾：29蒸馏水：300mL将碘与碘化钾先行混合，加入少许蒸馏水，充分振摇，待完全溶解后再加入其余的蒸馏水，当溶液由棕黄色变为淡黄色时即应弃取。2SL 355200663脱色剂95乙醇。64复染剂沙黄：025995乙醇：10mL蒸馏水：90mL将沙黄溶于乙醇中，待完全溶解后加入蒸馏水。7试验步骤71水样的采集和保存711水样的采集采样瓶使用500mL已灭菌的磨口玻璃塞广口瓶，采集水样时，应避免瓶盖及瓶子颈部受杂菌污染。灭菌后的采样瓶2周内未使用，需重新灭菌。712水样的保存采集好的水样需放置约4冷藏设备内保存运输。一般要求在采集4h内测定。72水样接种量
10、721生活饮用水接种水样总量300mL：在2个装有已灭菌50mL浓乳糖蛋白胨培养液的大试管或锥形瓶中(内有倒管)，以无菌操作各加入水样lOOmL；在lo支装有已灭菌5mL浓乳糖蛋白胨培养液的试管中(内有倒管)，以无菌操作各加入水样lOmL。722受到不同程度污染的水将水样充分混匀后，根据水样污染程度确定水样接种量。每个水样至少用3个不同的水样量接种。同一接种量要有5管。未受污染的水样接种量为lOmL、1mL、01mL。受污染水样接种量应根据污染程度加大稀释度，可接种1mL、01mL、0OlmL或接种01mL、0OlmL、0001mL等。如果体积为lOmL，则试管内应装有浓乳糖蛋白胨培养液5mL
11、；如接种量不多于lmL，则可接种于乳糖蛋白胨培养液lOmL中。使用的水样量可参考表1。表1接种用水量参考表接种量(mL)水样种类10 l 01 10 2 10 3 10 105 106较清洁水 一般污染水 严重污染水 以接种水样量lOmL、1mL、01mL为例：于各装有5mL浓乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，以无菌操作各加入lOmL水样；于各装有lOmL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，以无菌操作各加入1mL水样；于各装有lOml。乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)，以无菌操作各加入lmL 1：10稀释水样。共计15管，3个稀释度。73初发酵试验将已接种的水样混匀后置于
12、37C恒温内培养24h士2h。产气和产酸的发酵管表明试验阳性。如果3SL3552006倒管产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。74复发酵试验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中，在445恒温培养24h土2h，培养后立即观察，发酵管产气表明确信试验阳性。75平板分离将产气发酵管接种于伊红美蓝培养基上，置445 6C培养1824h，凡出现下列特征的典型菌落，证实为粪大肠菌群阳性：深紫黑色，具有金属光泽的菌落；一紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；淡紫黑色，中心色较深的菌落。挑取菌落的一小部分进行涂片，革兰氏染色，显微镜下镜检。8结果计算81以
13、721为水样接种量，根据试管有粪大肠菌群存在的阳性管数查表2，报告每升水样中的粪大肠菌群数。表2粪大肠菌群检数表lOOmL水量的阳性管(瓶)数lOmL水量的阳性管数 1每1L水样中粪大肠菌群数 每1L水样中粪大肠菌群数 每1L水样中粪大肠菌群数0 230注：接种水样总量300raL，其中2份100mL、10份10mL。82以722为水样接种量，根据试管有粪大肠菌群存在的阳性管数查表3，报告每lOOmL水样中的粪大肠菌群数。如果接种的水样量不是lOmL、lmL、01mL，而是较低或较高的3个浓度的水样量，也可根据粪大肠菌群最可能数检数表，按照3个浓度阳性管数，查表3求得粪大肠菌群最可能数(MPN
14、指数)，再经式(1)换算成每lOOmL的粪大肠菌群最可能值(MPN值)： MPN=MPN指数翻罹曝lO习(mFL)丽，(1)报告1L水样粪大肠菌群数，MPN值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群数。9注意事项91水样在采集、运输、保存、测定过程中应不受污染。4衰3粪大肠菌群最可能数(MPNj检数裹SL 3552006出现阳性份散 每100mL水样中粪大肠 出现阳性份数 每lOOmL水样中粪大肠lOmL管 1mL管 01mL管 菌群数的最可能数 】OmL管 1mL管 01mL管 菌群数的最可能散O 2 4 2 1 261 3 271 32 4l 231 4 l 341 1 41 6 331 2
15、6 5 1 462 5 2 632 1 21 5 702 1 5 22 5 312 5 3 l】03 8 5 3 1403 1 5 3 33 1 11 130l 1 14 5 】 1702 14 5 2 2203 2 1 5 4 3 2803 17 5 3504 13 5 5 2401 17 5 5 1 350l 17 5 7 5 2 5404 1 2】 5 5 9201 2 26 5 4 16002 22 5 5 2400注：接种水样总量555mL，其中5份lOmL、5份1mL、5份01m1。92试验过程中所用玻璃器皿均应要求无菌。93带菌培养基应灭菌后再弃去，其他遵守实验室安全制度。94检验开始前应充分振摇混合水样，以保证粪大肠菌群数量的准确性。95对于荇染严重的水样，为了保证在接种后得到一个合适范围的阳性结果，应设置不少于4个的连续稀释度；当4个连续稀释度的最低管或全部呈现阳性，应加大稀释度。96若复发酵试验阳性结果明显，平板分离试验可以省略。5
