1、中华人民共和国出入境检睡检疫行业标准SN/T 1617-2005 可可脾枝病毒检测方法Detection of Cacao swoHen shoot virus 2005-08-18发布0606080(01l6 2006-02心1实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准可可肿枝病毒检视j方法SN/T 1617-2005 号令中国标准出版社出版发行北京复兴门外五垦河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷A 开本880x 1230 1/16 印张o.75 字数17千字2005年11月第一版
2、2005年11月第一次印刷A 书号:155066 .乞16463定价8.00元如有印模差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533自U爵本标准的附录A、附录B、附录C为规范性酣录，附录D为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并由口。SN/T 1617-2005 本标准由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所负责起草，中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局参加起草。本标准主要起草人:魏梅生、相宁、李桂芬、吴翠萍、郭京泽。本标准系首次发布的市入境检验检疫行业标准。可可肿枝病毒检测方法1 范围本标准确立了可可肿枝病毒检测的基
3、本原则和方法。本标准适用于可可肿枝病毒进境种质的检疫检测。2 原理2. 1 可可肿枝病毒学名与分类地位学名:Cacao swollen shoot virus 缩写:CSSVSN/T 1617-2005 分类地位:花椰菜花叶病毒科CCaulimoviridae) ;杆菌状DNA病毒属CBadnavirus)。2.2 寄主范围重要的自然寄主有可可(Theobromacacao)、厚皮可乐果(Colachlamydantha)、吉贝CCeibaentandra)大可乐果变近无毛变种(Colagigantean var. glabrescens)和一种苹婆属植物Sterculiatraga cant
4、l归l山G。人工接种还可侵染木棉科(Bomb加CC臼Ee)、锻树科(门J盯I(Mlvceae)等3O种植物，其中猴面包树CAdmsni叩digit阳t阳)和C-，沁丁沾olaCordifoli叩易感病。2.3 病害症状2.3. 1 肿枝生长较快的枝条节、节间和末梢发生肿大，一些分离物还能使根部，特别是根尖产生肿大，有时侧根坏死。肿茎和肿根症状中，次生木质部和韧皮部都有所增加，但木质部不发生坏死。2.3.2 叶片叶片上的症状最初表现出明脉，形成网纹状，接着沿叶脉变红，随着叶片变绿而坚硬，红脉逐渐消失，有的叶片则产生褪绿.叶片褪绿斑部分组织不分化，其中有小型退化的叶绿体，细胞间隙缩小。2.3.3
5、果实幼嫩的果英，形成墨绿或浅绿的斑驳，后期则发展成深红色大理石状纹。受侵果英三是圆形比正常的果英小，其中可可豆的质量只有健康的一半，可可豆比正常的要扁平，子叶是灰白色。2.4 分布地区分布于加纳、科特迪瓦、周日利亚、多哥、塞拉科昂、斯里兰卡、马来西亚。2.5 传播途径EJ可肿枝病毒可通过嫁接、机械接种和多种粉蛤传播。粉蛤传播最主要的种有启兰粉蛤(Planococcoides njalensis)、肯尼亚咖啡粉蛤(Planococcuskenyae)、情粉蛤(Planococcus citri)和热带弗氏粉蛤CFerrisia virgata)。若虫和雌成虫是有效的传毒介体，但雄成虫不传播病毒，
6、粉蛤的传毒机制比较接近于半持久性，但尼兰粉蛤若虫在饵毒后蜕皮仍有保毒能力。2.6 粒体形态可可肿枝病毒校体杆菌状，长度为121nm130 nm，宽为28nm。2. 7 基因组病毒基因组为双链环状DNA，有2个不连续区，基因组全序列为7.4kb o SN/T 1617-2005 3 仪器设备、用具及试荆3. 1 仪器设备透射电子显微镜、酶联检测仪、天平(感囊，1/1000 g)、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅等。3.2 用具可调移液器(200L、20L、2L)、可调移液器头、酶联板、eppendorf管、指型管、研钵等。3. 3 试剂酶联测定试剂(见附录A)、免疫
7、诱捕聚合酶链式反应检测试剂(见附录B)和电镜观察样品前处理试剂(见附录。4 检测方法4.1 诊断寄主可可Amelonado品种对CSSV很敏感，可可豆经粉蛤传毒或机械接种.幼苗在20d30 d内，叶部出现沿脉变红及褪绿症状，2周12周后肿大，根变成水龙头状。黄麻属植物(Corchorusspp. )对多数毒株敏感.很快死亡。有些毒株引起吉贝，厚皮可乐果，大可乐果暂时沿叶脉褪绿症状，猴面包树发生明显的长期褪绿和严重矮化。4.2 双抗体夹心酶联免瘦吸附诅)J定见附录Ao4.3 免疫诱捕聚合酶链式反应检测见附录Bo4. 4 免控电子显微镜观察见附录co4.5 可可种菌的检验鉴定种于隔离温室中的待检种
8、茵长出叶片后，取叶片做酶联测定(见附录A)，结果为阳性的再用免疫电镜观察(见附录。、免疫诱捕聚合酶链式反应检测(见附录B)、生物学测定(参见附录D)三种方法中的2种3种进行复验。5 结果判定在酶联测定为阳性后，免疫诱捕聚合酶链式反应检测为阳性或免疫电子显微镜观察结果为阳性，即可判断为可可肿枝病毒。必要时可进行生物学传毒测定，并进行复验。6 样晶保存与复核6.1 样品保存鉴于可可月中枝病毒为检疫性有害生物，应做好以下准备，并在一周内接受复核。病毒要有活体样品存在.其他实验样品应妥善保存于40C冰箱中，以备复核。6.2 结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点
9、、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。生物学测定需有鉴别奇主的症状照片，电镜观察需有病毒粒体照片，酶联测定需有酶联板反应的照片和原始数据.免疫诱捕聚合酶链式反应检测需有电泳结果照片。6.3 复核出国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。? 附录A(规范性附录)双抗体夹心爵联免菇眼附测定A.1 试材A. 1. 1 酶联极的要求使用质量有保证厂商生产的腾联极。A. 1.2 包被抗体特异性的可可肿枝病毒抗体。A. 1.3 酶标抗体碱性磷酸甜酶标记的可可肿枝病毒抗体。A. 1.4 底物对硝基苯磷酸二锅。A. 1.5 样品抽
10、提缓冲波(pH7.4)PBSI、亚硫酸纳(Na2S03) PVP(MW24 00040 000) 叠氮化铀(NaN3) 40C储存。A. 1.6 包被缓冲液(pH9.6)碳酸铀(Na2C03) 般酸氧铀(NaHC03) 叠氮化铀(NaN3) 蒸馆水定容至1L.40C储存。A. 1.7 PBST缓冲液(洗涤缓冲液pH7.4)氧化铀(NaCD磷酸氢二铀(NazHPO!) 磷酸二氢捍(KHzP04) 氧化锦(KCl)Tween-20 蒸锢水定容至1L。A. 1.8 酶析、抗体稀释缓冲渣(pH7.4)1 L 1. 3g 20 g 0.2 g 1. 59 g 2.93 g 0.2 g 8.0 g l.
11、15 g 0.2 g 0.2 g 0.5 mL PBS丁1L BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉2.0 g PVP(MW24 00040 000) 20.0 g 叠氮化铀(NaN3)0.2g 40C储存。A. 1.9 底物(NPP)缓冲液(pH9.8)氧化镜(MgClz)O. 1 g 叠氮化铀(NaN3)0.2 g 工乙醇胶97 mL SNjT 1617-2005 3 SN/T 1617-2005 溶于800mL蒸锚水中，用盐酸调pH值至9.8，蒸馆水定容至1L，4C储存。A.2 程序A. 2.1 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，加茧，37C孵育2h，清空孔
12、中溶液，PBST洗涤3次，每次3min。A.2.2 样晶制备待测样品按1: 10(质量浓度)加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000 r/min离心10min，上清即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。A.2.3 加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，100L/孔，加盖，4C冰箱瞬育过夜，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸俑水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min, A.2.4 加酶析、抗体用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到爵联板中，每孔100L，加盖，37C孵育4h，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸锚水洗涤1次，PBST洗涤3次，
13、每次3min。A. 2. 5 加底物将底物NPP加入到底物缓冲破中使终被度为1mg/mLC现配现用)，按每孔100L，加入到酶联板中，室温避光孵育。A. 2. 6 读数在不同的时间内如30min、1h、2h、或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显色情况。A.3 结果判断A. 3.1 对照孔的OD405值(缓冲破孔、期性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制泡围内，即:援冲液孔和阴性对照孔的OD405值小于0.15，当阴性对照孔的OD405值小于O.05时，按0.05计算:阳性对照OD405值/阴性对照OD405值大于510;孔的重复性基本一致。A. 3. 2 在满足了A3.1质
14、量要求后，结果原则上可判断如下:样品OD.j05值/期性对照OD川值明显大于2，判为期性;样品。D405值/阴性对照OD405值在阁值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证;样品OD川值/阴性对照OD405值明显小子2，别为阴性。A. 3. 3 若满足不了A3.1质量要求，则不能进行结果判断。4 SN/T 1617-2005 附录B(规范性附录)免瘟诱捕聚合酶链式反应检测B. 1 试荆B. 1. 1 抽提缓冲液B. 1. 1. 1 10 mmol/L丁rispH7. 5，含l%SDS和1mrnol/L EDTAa B. 1. 1.2 10 mmol/L Tris pH7. 8，
15、含O.5%SDS, 5 mmol/L EDTA , O. 5 mg/mL的K蛋白酶。B. 1.2 3 mol/L醋酸铀(pH5.2) 称取408.1g含3个分子结晶水的乙酸铀，洛于800rnL水中，用冰乙酸调查pH5.2，定容至1L，分装高压灭菌。B. 1.3 50 X TAE 丁ns冰醋酸242 g 52.1 mL EDTA铀.2日2037.2 g 加蒸锢水至1L用时加蒸馆水稀释至1XTAEaB. 1.4 6 X加样缓冲i夜0.25%澳盼蓝40%(质量浓度)蔚糖蒸锚水溶液B. 2 实验步骤B. 2.1 样品处理B. 2.1.1 包被抗体1. 5 rnL聚丙烯离心管用400L浓度为4问/mL的
16、CSSV多克隆抗体包被.37aC孵育2h，用PBST(含0.05%Tween-20)洗涤3次。B. 2. 1. 2 样品DNA抽提加入按1: 10稀释的植物样品抽提液(用酶联样品抽提缓冲液)400L，4aC孵育过夜(或至少37C脾育2h)。用PBST洗涤3次。用下面两种方法抽提样品DNA:a) 400L，10 mmol/L ris pH7. 5，含1%SDS和1rnmol/L EDTA，充分泪合，55C牌育15 min , b) 400L，10 rnmol/L Tris pH7. 8，含O.5%SDS, 5 mrnol/L EDTA , O. 5 mg/mL的K蛋白酶37Cffl障育30min
17、a B. 2. 1. 3 有机溶剂处理用水饱和酣:三氯甲脆:异戊醇(25: 24 : 1)进行抽提，再用三氯甲烧:异戊醇(24: 1)抽提2次.核酸用O.1体积的3mol/L乙酸销和2.5体积的乙薛(96%沉淀。沉淀用70%的乙醇洗2次，真空干燥，并重新悬浮在10L的灭菌蒸馆水中。为了避免病样中病毒浓度低.通常将4个样品中抽提到的DNA放在一起，取10L作PCR试验用。B. 2. 2 51物合成有3对引物可供选择第1对序列为:P1:5-ATGATTATGGGCGGTTAG -3 P2:5-AC丁GTTGGCTGCTGACTC-3 D SN/T 1617一2005PCR产物大小为670bp。第2
18、对序列为:问:5 -GG ATG AAG ATGCCACCAG-3 P4，5人GTTGTGCTCCCATTGGTG-3 PCR产物大小为640bpo第3对序列为:P9:5-ACAGGAGGGGAAGTGAT-3 P6，5人CAGAAG丁GGCAGTTGATG-3 PCR产物大小为1560bp。B. 2. 3 PCR反应10L的样品DNA抽提物加入到以下的PCR反应体系中(10X的反应液，20mmol/L引物5L，1. 25 mmol/L dNTP 8L，0.5 UTaq酶)，用灭菌水将反应体积调到50L。先950C，变性5min;然后按94C、90s，52C、30s，720C、90s进行循环;
19、循环30次40次;最后在72C，延伸5min。反应结束后，取10LPCR产物进行琼脂糖电泳。B. 2. 4 琼脂糖电泳B. 2. 4. 1 制备凝胶将TAE和电泳级琼脂糖按1.0%(质量浓度)配好，在微波炉中熔化混匀，冷却至55CB.2.4.2 加漠化乙链加入澳化乙链浓度为O.5g/mL.混匀，但j入巳封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝腔凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加入足够量的丁AE(缓冲液没过凝胶表面约1mm)。B.2.4.3 加样用适量的(约2L3L)6X加样缓冲液分别与10L样品?昆合，然后将其和适合的DNA分子量标准物分别加入到样品孔中。B. 2. 4. 4 电泳接通电源使
20、DNA向阳极移动。当加样缓冲被中的?臭酣蓝迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。将整个胶置于紫外透射仪上观察。B.3 结果判断6 通过观察，若有相应大小的产物带出现，即可判定为阳性。注:CSSV各分离物血清学关系的远近将影响到IC子CR的检测结果。理附录C(规范性附录)免瘟电子显微镜观察C.1试jfIJc. 1. 1 0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH6.1)。C. 1. 2 5 mmol/L DIECA(二乙基二硫代氨基甲酸锅，也称铜试剂)。C. 1. 3 o. 5%PEG 6000。C. 1.4 1%果胶酶。C.2 实验步骤C. 2. 1 Formvar膜制作SNjT 1617-200
21、5 将聚乙烯薛缩甲醒(Formvar)溶于三氯甲烧，配成0.2%0.3%溶液，贮于冰箱内备用。制膜时取一块干净的玻璃片插入洛液中，取出倾斜待溶液挥发，用锋利的刀片沿政璃边划痕，再将玻璃片以450角缓慢插入蒸锚水中，使薄膜从玻片上脱落下来漂浮于水面，将新的、规格为230目的铜网小心摆上，再用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养血中干燥备用。C.2.2 电镜样品制备C. 2. 2.1 样品的制备取幼嫩的可可病叶10mg，加20mg左右的金刚砂和0.05mol/L的PB缓冲液(含5mmol/L二硫苏糖黯或乒琉基乙醇，5mmol/L DIECA , O. 5%PEG 6 000，1%果胶酶，调pH6. 1
22、)0.32 mL充分研靡，370C孵育2h后，室温6000 g离心2mn，上清留作电镜制片用。C. 2. 2. 2 诱捕将一滴1: 1000稀释的CSSV抗血清置于石蜡板上，用表面覆盖有Formvar膜的铜闷放在上面室温孵育10mn后，用滤纸将铜网吸干，蒸锚水洗铜网，再吸干。然后放在制备好的样品上分别解育15 mn、20mn、60mn，同时用未经抗血清孵育的铜网作对照。用滤纸将铜网吸干，蒸锚水洗铜网，再吸干。C.2.2.3 负染用1%2%醋酸双氧铀或1%铅酸锻负染2mn3 mn，琼干后即可在透射电镜下观察。C.3 结果判断和未经抗血清孵育的锢网相比，诱捕的铜闷在相同的视野下，观察到数量较多的长
23、度为121nm 130 nrn，宽为28nrn的杆葡状病毒粒体，则结果是阳性。山OON-h户川江HZSNjT 1617-2005 附录。(资料性附录)生物学测定嫁接将具有肿枝症状的芽作为接穗，接于健康的础木上，在出芽后的6周到2个月的时间内，叶部症状为褪绿。芽上的嫩叶萎需.只剩下具托叶的绿色枝条。茎上的腋芽常抽出2根3根枝条，多数枯死.枝条基部肿大，最终症状为主茎肿大。上述症状在芽接后的5个月8个月内出现，并常引起顶死。D.1 机棋接种由尼兰粉虫r接毒的推面包树和BombaxhrevcusE幼茵分别在接种后2周10周和20周30周收获，在收获前将苗放在弱光下处理24h48 h，收获后的病叶，除
24、去叶脉，用含有磷酸盐、半脱胶酸、乙二按四乙酸盐溶液真空浸透，第一次浸透后将溶液倒掉，叶片在新鲜溶液中再浸透一次，取出叶片在预冷的研钵中研磨.所得的粘液涂于半粒可可盟的内表和胚部，冲洗后，次日种植。D.2 介体传播D. 3.1 饲毒出现症状的幼嫩病叶是给粉虫fr饲毒的最好毒掘。饲毒前的禁食有利于提高传毒效率，但不要超过10 h。最短饲毒时间为20min，最适为50min，或2d4 do最短接毒时间为15min，通常最大的传毒效率发生在2h10 h内。D. 3. 2 接毒D. 3. 2.1 测试檀物10个月龄12个月龄的可可树、发芽可可幼苗或可可豆可作为测试植物。10个月龄12个月龄的可可树接种后
25、潜伏期为17d49 do 3周5周的幼茵潜伏期平均为31d，可可望则为17d25do吁吁豆的子叶是测试接毒效果的最好材料，对可可树或幼苗来说，每株接5头粉蛤可望能获得30%的传毒卒，而吁吁豆传毒效率能达100%。D. 3. 2. 2 可可豆的接种方法自成熟果英中取出可可豆，去壳将其中一子叶解剖开.暴露出另子叶的内面.将饲毒后的昆虫小心地刷到在玻璃罩内放置的可言I豆上.用滤纸保;粟，当接毒试验完成后用尼古丁i容液杀死昆虫。可可豆种子防虫的消毒砂子中。传毒试验常在2goC360C条件下进行。可可豆刚发芽时无症状，待第一、第一、第三对真叶出现时，就陆续显现症状。D.3 JUm-dilM究刊一负必刊一。权。r-J侵-8等hm一有囚一二Im内md咱、14Am山附号一价自书一定FD nu nu n/叮I-nhu 1 i / M川FG
