1、ICS 1104040C 45 、中华人民共和国医药行业标准YYT 060682008组织工程医疗产品第8部分：海藻酸钠Tissue engineered medical products-Part 8：Alginate200804-25发布 20090601实施国家食品药品监督管理局 发布刖 昌YY0606组织工程医疗产品分为：第1部分：通用要求；第3部分：通用分类；第4部分：皮肤产品的分类；第5部分：基质及支架的性能和测试；第6部分：I型胶原蛋白；第7部分：壳聚糖；第8部分：海藻酸钠；第9部分：透明质酸；第10部分：修复或再生关节软骨的植人物体内评价；第12部分：细胞、组织、器官的加工处理
2、。本部分为YY0606的第8部分。本部分的附录A、附录B、附录C是规范性附录，附录D是资料性附录。本部分由国家食品药品监督管理局中检所医疗器械质量监督检验中心归口。本部分由国家食品药品监督管理局中检所医疗器械质量监督检验中心起草。本部分主要起草人：孙雪、奚廷斐、陈亮。YYT 060682008组织工程医疗产品第8部分：海藻酸钠YYT 0606820081范围YYT 0606的本部分适用于制备组织工程医疗产品及外科植入物的海藻酸钠。2规范性引用文件下列文件中的条款通过YYT 0606的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本
3、部分，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GBT 191包装储运图示标志GBT 282812003技术抽样检验程序第1部分：按接受质量限(AQL)检索的逐批检验抽样计划GBT 1688612001医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验(idt ISO 109931：1997)GBT 168863 1997 医疗器械生物学评价 第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验(idt ISO 109933：1992)GBT 1688642003医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择(ISO 109934：2002
4、，IDT)GBT 1688652003医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验(ISO 109935：1999，IDT)GBT 1688661997医疗器械生物学评价第6部分：植入后局部反应试验(idt ISO 109934：1994)GBT 1688610一2005 医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验(ISO 1099310：2002，IDT)GBT 16886111997 医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验(idt ISO 1099311：1993)GBT 16886122005 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品(ISO 1099312：2
5、002，IDT)YYT 0313-1998医用高分子制品包装、标志、运输和贮存中华人民共和国药典(2005版)美国药典USP26NF21海藻酸钠ASTM F206400作为用于生物医学和组织工程医用产品初始材料的海藻酸盐的表征和试验标准指南ASTM F225903用于检测海藻酸盐的化学成分和序列结构的1H一核磁共振(1H NMR)标准实验方法3术语和定义下列术语和定义适用于YYT 0606的本部分。31分解decomposition由于暴露在环境中，化学的或热的因素导致海藻酸钠结构的改变，例如温度高于180。分解作用1YYT 060682008可导致海藻酸钠产生毒性变化。32降解degrada
6、tion降解是指材料的化学结构、物理性质或外观发生改变。聚合物的降解通常依靠酸催化水解，断裂糖苷键来实现，在受热时也常会发生降解。降解不是分解。对聚合物而言，降解通常是指解聚。33解聚depolymerization解聚是指聚合物链的长度缩小成为较短的链段。解聚可以将聚合物变为寡糖和或单糖单元。对海藻酸钠而言，糖苷键的水解是解聚的首要因素。34水合胶体hydrocolloid当水合时水溶性聚合物形成的胶体。35平均分子量molecular mass average(molecular weight average)平均分子量最常用的表达方式是数均分子量(M。)和重均分子量(M，)，其计算公式如
7、下：M。一N。MjN，M，一口uiMiw，一N；M?N。Mi式中：N：具有特定分子量Mi的分子数量；w。具有特定分子量Mi的分子质量。在一个多分散体系中，M，M。M，M。即分子量分布数值，海藻酸钠的M，M。通常在1o30之间。4要求41性状应为白色或淡黄色粉末状固体。42鉴别通过傅里叶变换红外光谱(FI-IR)检测且其典型特征峰(cm一1)为：3 3753 390(b)，1 613(s)，1 416(s)，1 320(w)，1 0501 125(b)，903(m)，600710(b)。其中，S：强带；121：中级带；w：弱带；b：宽带。43结构组成采用1 H一核磁共振光谱(NMR)检测，典型1
8、 HNMR谱如图1所示。C图1YYT 06068200844平均分子量及其分子量分布平均分子量应符合产品标示值并注明检测方法。海藻酸钠的分子量分布数值在1o30之间。45干燥失重应不大于150(质量分数)。46灰分应为180270(质量分数)。47重金属含量以铅计重金属总量应不大于0004(质量分数)，其中砷含量应不大于0000 15(质量分数)，铅含量应不大于0001(质量分数)。48蛋白质含量应不大于03(质量分数)。49细菌内毒素应不大于05 EUmL。410微生物限度细菌总量应不大于200 CFU。411生物学评价4111 细胞毒性试验：细胞毒性反应应不大于1级。4112皮内刺激试验：
9、原发性刺激指数(P)应不大于04。41 13致敏试验：应无皮肤致敏反应。4114急性全身毒性试验：应无急性全身毒性反应。41 15溶血试验：溶血率应不大于5。4116植人试验：皮下植入14 d、30 d和90 d，组织反应与阴性对照无显著差异。4117遗传毒性试验：应无遗传毒性。5试验方法51性状肉眼观察，应符合41规定。52鉴别通过傅里叶变换红外光谱(FLIR)测定(溴化钾压片法)，应符合42规定。53结构组成采用1 H一核磁共振光谱(NMR)检测，试验方法详见附录A，应符合43规定。54平均分子及其分子分布平均分子量可通过以下两种方法来确定：特性黏数法，以及凝胶渗透色谱联合多角度激光散射测
10、定仪(sEC_MALLs)测定分子量。试验方法详见附录B，应符合44规定。55干燥失重采用中华人民共和国药典(2005版)-部附录L规定的方法测定。应符合45规定。56灰分按照中华人民共和国药典(2005版)一部附录K的方法测定，推荐应在800下灼烧至少6 h。应符合46规定。57重金属含量按照中华人民共和国药典(2005版)一部附录B第一法原子吸收分光光度法测定，应符合47规定。3YYT 06068200858蛋白质含量按照附录c规定的方法测定，应符合48规定。59细菌内毒素按照中华人民共和国药典(2005版)-部附录E规定的方法进行测定。应符合49规定。510微生物限度按照中华人民共和国药
11、典(2005版)-部附录J规定的方法测定，应符合410规定。5”生物学评价5”1细胞毒性试验按照GBT 1688612规定的方法制备实验样品，然后按照GBT 168865规定的方法测定，应符合4111规定。5112皮内刺激试验按照GBT 1688612规定的方法制备实验样品，然后按照GBT 16886i0规定的方法测定，应符合4112规定。5113致敏试验按照GBT 1688612规定的方法制备实验样品，然后按照GBT 16886合4113规定。51I4急性全身毒性试验按照GBT 1688612规定的方法制备实验样品，然后按照GBT 16886合4114规定。10规定的方法测定，应符11规定的
12、方法测定，应符5115溶血试验按照GBT 1688612规定的方法制备实验样品，然后按照GBT 168864规定的方法测定，应符合4Ii5规定。5116植入试验按照GBT 1688612规定的方法制备实验样品，然后按照GBT 168866规定的方法测定，应符合4II6规定。5117遗传毒性试验按照GBT 1688612规定的方法制备实验样品，然后按照GBT 168863规定的Ames试验、微核试验和染色体畸变试验方法进行测定，应符合4117规定。6检验规则61批检验611产品以同日投料，同一工艺生产的产品为同一批号。612批检验应进行41，45，46，47，48，49，4i0的检测。62型式检
13、验621型式检验为全性能检验。622型式检验时，若所有检验项目全部合格，则判定为合格，否则判定为不合格。63抽样检验抽样方案按照GBT 28281进行。7标志71大包装应有下列标志：a)生产厂名和地址；b)产品名称；4c)产品注册号和执行标准编号；d)分类和规格；e)生产批号或日期；f)失效日期；g)贮存条件。72小包装应有下列标志：a)产品名称；b)生产厂名和地址；c)分类和规格；d)生产批号或日期；e)原料来源；f)失效日期；g)贮存条件。73储运标志应符合GBT 191中的规定。8包装、运输和贮存81包装应采用适宜的包装，确保海藻酸钠产品的安全性和有效性。82产品的包装、贮存、运输应符合
14、YYT 0313的规定。YYT 060682008YYT 060682008附录A(规范性附录)海藻酸钠的结构组成和序列结构的1 H-核磁测试方法A1范围A11本检测方法用于制备组织工程医疗产品及外科植入物的海藻酸钠。A12描述海藻酸钠的参数，包括FG(G含量)，FM(M含量)MG、NG1(连续G单元的平均数量大于1的数值，即不包括一MGM-在内的G单元的平均长度)等。A2使用和有效性采用1HNMR的方法进行测定时，海藻酸钠溶液的黏性有可能导致NMR谱线加宽，从而影响测定结果。因此在测定前，需要先通过条件温和的部分水解降低海藻酸钠样品溶液的黏性。把海藻酸钠溶解于99DzO中之后冻干，再将其溶解
15、于999D20再冻干从而制备低1H20含量的样品。三乙烯四胺六乙酸(TTHA)被用作螯合剂以防止二价阳离子与海藻酸钠反应，这种反应可以导致谱线加宽以及信号强度的选择性丢失。A3材料A31化学物质A311海藻酸钠样品。A312去离子水。A313 HCI溶液(1 moIL，01 moIL)。A314 NaOH溶液(1 molL，01 toolL)。A315 D20(99999，999)。A316三乙烯四胺六乙酸(TTHA，D20中03 molL，DCI或NaOD调pH值至555)。A32仪器A321分析天平(01mg)。A322振荡器。A323 pH计。A324水浴(100)。A325冻干装置。A
16、326 NMR仪(推荐300MHz区域强度或更高)。A4步骤A41样品制备A411制备100mLlmgmL海藻酸钠水溶液。A412 HCl溶液(1 molL，01 toolL)调pH值为56，将其置于100水浴中1 h。A413 HCl溶液(1 molL，01 toolL)调pH值为38，将其置于100水浴中30 min。A414 NaOH溶液(1 molL，01 toolL)调pH值为78，冻干样品过夜。A415在99999D20 5 mL中溶解海藻酸钠样品，再次冻干。A416在999D20 1 mL中溶解海藻酸钠样品10 regal2 mg。A417在NMR样品管中加入07mL海藻酸钠样品
17、，再加入20 pL，03molLTTHA。6YYT 060682008A42技术参数A421酸钠1H-NMR参数1HNMR应在80，20 Hz的标准一围脉冲中获得。原子核 1H质子谱带宽度(8) 一o595扫描次数 64弛豫时间 2 S质子脉冲角度 90。扫描时间4096 S取得样品数据点的数量取决于谱带宽度(Hz)和扫描时间；32 768(400 Hz时)推荐使用数字式滤器以及适合的数字信号处理器以获得良好的基线。A422参考谱图见图1。A43计算A431 zHNMR数据由一系列方程式或影响因素进行计算。这些因素包括(i)数据的最高平均数；(“)保证黏度(例如，FMFMM+FMG)。在图1中
18、显示了信号A，B1，B2，B3，Bt和c的积分强度。1HNMR中这些信号的意义如下：reda： alpha reducing-endsA： Gred-b： beta reducing-endsBl： GGMB2： MGMB3： MGB4： 丛MC： 鱼G海藻酸钠的化学成分和序列结构取决于信号的强度，它反映了各个成分的量。A432相关公式如下：G一06EA+C+o5(B1+Bz+B3)(A1)MB4+05(B1+B2+B3) (A2)GGo5A+Co5(B1+Bz+B3)(A3)MGGMo5(Bl+B2+B3) (A4)一Bt (A5)GGMA4GG一(B1)05(B1 q-Bz+B3)(B1
19、q-B2)(A6)MGM一(B2)05(B1+Bz+B3)(B1+Bz) (A7)0GGGGoGMFGG(M+G)FMM(M+G)FGGGG(M+G)FMMMM(M+G)FGMFMGj垤：(M+G)FGGG一(珏G(M+G)FMGMA女：M(M+G)FGGMFMGG一0GM(M+G)(A8)(A9)(A10)(A11)(A12)(A13)(A14)(A15)(A16)7YYT 060682008NGFGFGM (A17)NG1一(FGFMGM)Fc,c,ra (A18)NMFMFMG (A19)如果reducing end signals也被积分(“red-a”和“redb”)，则平均聚合度的
20、评估公式如下：DP。一(M+G+red-a+red-b)(red-a+red-b)(A20)式中：GpL_古罗糖醛酸；Mpn甘露糖醛酸；GG、GGG一”L-古罗糖醛酸聚合嵌段；MM、MMM一n甘露糖醛酸聚合嵌段；MG、GGM、MGMnL-古罗糖醛酸和口甘露糖醛酸聚合嵌段；FGqL_古罗糖醛酸含量；FMn甘露糖醛酸含量；FC,G、FGGGL_古罗糖醛酸聚合嵌段含量；FMMn甘露糖醛酸聚合嵌段含量；FGM、FMGM、FGGM”L-古罗糖醛酸和pn甘露糖醛酸聚合嵌段含量；NG连续的tL_古罗糖醛酸单体的平均数量；NG1连续的tL_古罗糖醛酸单体的平均数量大于1的数值，即不包括一MGM-在内的G单元的
21、平均长度；N”连续的n甘露糖醛酸单体的平均数量；DP。平均聚合度。A5标准偏差和结果A51 FG及其标准偏差(sD)应精确到001。A52 G含量高的海藻酸钠应给出G含量，例如，FG为068(标准偏差一士001)。M含量高的海藻酸钠应给出M含量，例如，FM为066(标准偏差一士001)。B1概述附录B(规范性附录)海藻酸钠平均分子量及其分子分布的测试方法YYT 060682008海藻酸钠的分子量决定着它的某些特性，如黏度和或胶体拉伸率等。由于上述原因以及这些特性的不同对最终用途的影响，采用直接或间接的方法测定海藻酸钠的分子量是十分必要的。海藻酸钠是一个确定分子量范围的多分散体系。分子量可用数均
22、分子量(M。)和重均分子量(靠)来表示。可以通过下述方式来测定：B2依据特性黏数测定海藻酸钠分子量特性黏数是描述单位质量聚合物在溶液中的流体力学体积，表征聚合物在特定溶剂和温度条件下的一种特性，与浓度无关，与聚合物的平均分子量成比例。特性黏数的计算公式为：MarkHouwinkSakurada方程们一KM，其中K为常数，M为平均分子量，a为描述聚合物组成的经验常数，通常为051。当a一1时，Mr一Mw。对海藻酸钠而言，在离子强度为01时(例如，01molL NaCl溶液)，其指数a接近于1。通过测定特性黏数，并已知样品的K和a值，则可确定聚合物的黏均分子量。特性黏数可以通过乌氏黏度计测定。整个
23、测定过程应确保在温度恒定为20，含有01 molL NaCl溶液和足够低的海藻酸钠浓度等条件下进行。其具体操作方法如下。精密称取105干燥6 h的海藻酸钠02 g，置于约50 mL的01 molLNaCl溶液中(内含005乙二胺四乙酸二钠)，放置24 h后溶解并稀释至100mL，按中华人民共和国药典(2005版)二部附录G第三法测定特性黏数(口)(温度控制在20士005)，其中K一2010，a一1，代入MarkHouwinkSakurada方程，即可计算得到海藻酸钠的平均分子量。B3 用凝胶渗透色谱(a勘与多角度激光散射测定仪(SlEC-MAUS)测定海藻酸钠平均分子量及其分子量分布多角度激光
24、散射测定仪作为测分子量用的附加检测器，不需标准品校准，克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的误差。由于通常无法获得海藻酸钠的标准品，GPC结合SEC-MALLS方法为测定其平均分子量提供了新的途径。色谱条件如下：采用TSK G4000Pwx色谱柱；多角度激光检测器及示差折光检测器；流动相为01 molL NaN03溶液；流速为05 mLmin。采用GPC结合SEC-MALLS，在6900 nm的波长和25下测定散射光强。海藻酸钠溶液的溶剂为超纯水。将样品按上述色谱条件进样，测定分子量及其分子量分布。由zi一图用外推法计算Mr。，M。以及分子量分布指数M，M。YYT 060682
25、008附录C(规范性附录)海藻酸钠蛋白质含量测定C1原理库马斯亮蓝G一250具有两种色调，在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后转为青色，且其色深浅与蛋白质的浓度成正比。c2设备C21分析天平。c22分光光度计。C23旋涡式混合器。c3溶液制备注：实验所用试剂均为分析纯。C31库马斯亮蓝G一250试液：称取库马斯亮蓝G一250 100 mg溶解于50 mL的95乙醇中，再加入85(体积分数)的磷酸100 mL，并用蒸馏水稀释至1 000 mL，置于棕色瓶内，室温贮存。C32蛋白质标准液：精确吸取5人血清白蛋白标准液02mL于1 000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，4下贮存。C4样品准备取海藻酸
26、钠约5 mg，精确称重，置于试管中，加1 000 mL蒸馏水后精确称重。充分振荡混匀，使其完全溶解。按式(c1)计算样品管中海藻酸钠含量(pgg)。P1一mlcmzd (C1)式中：m1海藻酸钠质量，单位为微克(pg)；mz海藻酸钠和蒸馏水的质量，单位为克(g)；c海藻酸钠测定浓度值，；d该浓度下测得的海藻酸钠密度，单位为克每毫升(gmL)。c5测定步骤C51按表C1制备蛋白质标准液系列。表c1 蛋白质标准管溶液系列浓度试管号 O 1 2 3 4 5蛋白质标准溶液mL 0 01 02 04 08 10蒸馏永mL 10 09 08 06 02 0蛋白质浓度(pgmL) O 1 2 4 8 10c
27、52在标准液系列的各试管及样品试管中分别加入5 mL的库马斯亮蓝C-250溶液。用旋涡式混合器使试管中溶液充分混合，并在温度(2010)下放置15rain。用0号管作对照，用分光光度计测定595 nm处各标准管和样品管的吸光度。10YYT 060682008c53用标准管绘制吸光度一浓度曲线，根据样品的吸光度值从标准曲线上查得样品管的蛋白质含量。C6结果表示按式(c2)计算海藻酸钠蛋白质含量P4()：尸4一P2p1100式中：P1样品管中海藻酸钠含量，单位为微克每克(-tgg)样品管中蛋白质含量，单位为微克每克(p-gg)。YYT 060682008附录D(资料性附录)背景资料D1背景“海藻酸
28、盐”是指1，4一糖苷键连接的pn甘露糖醛酸(M)和a一卜古罗糖醛酸(G)单元非支链二元共聚物家族。两种糖醛酸单体的数量以及它们的排布序列的不同取决于海藻酸盐的来源。糖醛酸单元沿着聚合物链排列成一系列的嵌段，嵌段形式是G单元均聚嵌段(G嵌段)，M单元均聚嵌段(M嵌段)以及M和G单元共存交替系列嵌段(MG嵌段)。因此，海藻酸盐分子不能单独用单体来描述。需要海藻酸盐链中M和G单元嵌段的NMR特征用于计算不同嵌段含量。NMR的检测结果也表明海藻酸盐不具有规则的重复单体。海藻酸盐会在制造过程中发生自然降解。海藻酸钠成品的分子量很少超过500 000 gtool，相当于聚合度大约为2 500。G(1C)唑
29、叩)型M(4C1)啦M(4C1)唑G(1C4)D2海藻酸钠产品的原料D21概述目前，大部分海藻酸钠是由褐藻中提取出来的，同时，细菌合成也可被用来制备海藻酸钠，已经建立了切实可行的发酵办法来制造一定等级的海藻酸钠。海藻主要自然生长在温带，但是大量的海藻在远东地区养殖，特别是靠近中国和日本的海岸线。植物的坚硬程度反应了G嵌段的含量。钙与海藻酸钠的结合可以提高海藻酸钠的交联度，使G嵌段长度的增加从而导致水凝胶强度的提高。D22海藻酸钠的化学组成和序列结构的变化海藻酸钠的化学组成和序列结构的变化与提取海藻酸钠的海草和海藻种类有关。表D1罗列了由不同海藻中提取的海藻酸钠成分的差别，同时表明在生物医药和组
30、织工程医疗产品应用中，必须规定和描述海藻酸钠的组成范围。依据最终用途的不同，海藻酸钠的化学组成和序列结构的范围可以增大或缩小。表D1海 藻 MC Mf Gf MM C,G寒带昆布属植物(茎) 045 30 70 18 58寒带昆布属植物(叶) 122 55 45 36 26寒带昆布属指状植物 122 55 45 39 29巨型囊肿梨形植物 150 60 40 40 20Lessonia nigrescens 150 60 40 43 23Ascophyllure nodosum 186 65 35 56 26Lminaria japonica 186 65 35 48 18Durvillea
31、antarctica 245 71 29 58 16Durvillea potarum 333 77 Z3 69 13YYT 060682008D23海藻酸钠的功能特性和应用D231对于大多数用于生物医药的海藻酸钠来说，其最重要的功能特性是黏性。可溶性、可膨胀性和成膜性是在生物医药应用中开拓的其他特性。D232凝胶化特性是与MG和M与G序列结构相关的功能。连续古罗糖醛酸单体形成G嵌段，它提供了海藻酸钠分子中能与多价阳离子交联的区域。在实际应用中，钙离子是最常用于交联阳离子。D233海藻酸钠的黏性与分子量和溶液中分子的构象有关。在高浓度的海藻酸钠溶液中，海藻酸钠与其他分子的相互作用和对水的竞争作
32、用影响着海藻酸钠溶液的流动特性。由于少量的钙离子或其他因素的存在，使海藻酸钠溶液发生交联而黏性增加。加人多价螯合剂可以避免这一现象的发生。D234不同原料加入的顺序也可导致海藻酸钠的凝胶化性质的改变。D235海藻酸钠的可溶性与海藻酸钠分子的分散度有关。pHi3时，海藻酸钠以海藻酸的形式存在。D236降解。就如32中描述的那样，断裂糖苷键可使海藻酸钠发生降解。与其他糖相比，在强酸中(通常用来将多糖转化成单糖的条件下)，糖醛酸中的糖苷键几乎不发生水解。pH小于1时，降解速率直接与质子浓度相关。当pH值接近于海藻酸钠的pKa值(即pH 14)时，降解速率不完全依赖于pH值。在这个范围内，除了由质子引
33、起的原因外，M和G的质子化形式对水解也有贡献。由于这个原因，在pH 1-5时，海藻酸钠不如其他的一些聚合物(如甲基纤维素)稳定。在pH 7-8时，海藻酸钠最稳定。pH值大于8时，会发生其他的降解反应。在绝大多数情况下，降解导致溶液黏度降低。YYT 060682008参考文献美国材料实验学会(AsTM)标准1ASTM F206400作为用于生物医学和组织工程医用产品初始材料的海藻酸盐的表征和试验标准指南2ASTM E386关于高分辨率核磁共振波谱实验的表征美国药典(uSP)3USP24-NFl9(761Nuclear Magnetic Resonance其他参考文献4HGrasdalen，BLa
34、rsen&Smidsrod(1979)APMRstudy of the composition andsequence of uronate residues in alginatesCarbohydrEes，68：23315HGrasdalen，BLarsen&Smidsrod(1981)13C-NMR studies of monomeric compositionand sequence in alginateCarbohydrRes，89：179-1916HGrasdalen(1983)High-field 1HNMR spectroscopy of alginate：sequential structure andlinkage conformationsCarbohydrRes，118：25526014
