1、GB/T 15805.11995 1 主题内容与适用范围 本标准规定了淡水鱼类传染性胰坏死病（IPN）、传染性造血器官坏死病（IHN）、病毒性出血性败血症（VHS）、斑点叉尾病毒病（CCVD）、鲤春病毒病（SVC）、疖疮病、弧菌病和昏眩病的检疫方法。 本标准适用于口岸进口国外淡水鱼类的检疫，也适用于我国国内地区间同种疾病的检疫。 2 设备和器械 检疫中所用设备和器械除根据各个学科有特殊要求外，均指鱼病实验室常用的设备和器械。 3 传染性胰坏死病 （Infectious Pancreatic Necrosis，简称IPN） 该病病原属双链RNA病毒。 本病流行于美洲、欧洲和亚洲。 主要感染对象是
2、鱼龄6个月以内的虹鳟、美洲红点鲑等鲑鳟鱼类。6个月以上的鱼可以是无症状的带病毒鱼，鱼卵也可携带病毒。 3.1 临床检查 3.1.1 活动情况 病鱼游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉入底部死亡。从开始回转游动到死亡的时间为12h。在有水流的饲养池中可见失去游泳能力的鱼随水流贴在排水口的拦网上。 3.1.2 外部检查 病鱼体色暗黑，眼球突出，腹部膨胀。腹壁和鳍基部有出血现象。病鱼多从肛门排出线状粘液样粪便。 3.1.3 剖检 除幽门垂出血外，肝脏和脾脏显著褪色，通常消化道内无食物，胃和肠前部积有乳白色粘液而肿胀。 3.2 实验室检验 3.2.1 病毒分离 3.2.1.1 细胞准备 a. 设备及器
3、械 无菌室、超净工作台、恒温培养箱、低温冰箱（30）、液氮罐、赛氏漏斗和0.3，0.45m混合纤维素酯微孔滤膜、细胞培养瓶、白色橡皮塞等。 页码，1/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm b. 培养基及试剂 细胞生长液、胰酶-EDTA（乙二胺四乙酸）混合消化液、小牛血清、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、酒精。 细胞生长液等配制方法见附录A（补充件）。 c. 接种前的细胞准备 传染性胰坏死病毒用CHSE-214、RTG-2细胞分离。CHSE-214、RTG-2最适培养温度分别为21和20。选择生长良好，形
4、成单层的细胞培养物，倒去生长液加入适量胰酶-EDTA混合消化液消化，然后补加生长液，按12或13 的分种率将原瓶消化的细胞分装入2个或3个培养瓶中，置适温中继续培养，当单层致密度达80左右，即可用于病毒接种。 3.2.1.2 样品接种 a. 设备及器械 同3.2.1.1条a的规定，另增加冷冻离心机和1、2mL规格的移液管。 b. 常用的溶液 细胞维持液、磷酸缓冲盐水配制方法见附录A（补充件）。 c. 取样 有症状的鱼，取10尾以上样品作病毒分离用。 无症状的鱼，取60尾以上样品作病毒分离用。 对鱼卵，取60100粒样品作病毒分离用。 对于少量进出口成鱼，从尾动脉抽12mL血液，其血浆作病毒分离
5、用，血清作抗体检测。 d. 样品处理 较大的鱼取其肾、肝、脾。仔、稚鱼取鱼体全部，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊。鱼卵则取全卵。 将上述待检样品称重，加磷酸缓冲盐水（PBS）匀浆，并稀释成10-1，离心30min（4 000r/min），弃去沉淀物，将上清液通过0.45 m微孔滤膜除菌，然后再用PBS进行10倍稀释，即成样品。 血液样品置于常温下1h后，再放在4下12h以上，以析出血清。然后低速离心，其沉淀作待检样品，按上述方法制备样品液，血清作中和试验。 e. 接种细胞 倒出细胞瓶中的培养液，然后接种样品液，接种量为维持液的10-1，吸附1h后，加细胞维持液培养，同时设对照。 页码，2/19G
6、B/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm3.2.1.3 病毒培养 传染性胰坏死病病毒（IPNV）培养温度是1520。在培养过程中每日观察细胞变化情况，观察7d结束。 3.2.1.4 结果观察 若接种样品含有病毒，培养25d后，即出现明显的细胞致病变作用（CPE），主要特征为细胞崩解，细胞单层破坏。收集阳性细胞悬液，冻融一次后，低速离心除去细胞碎片，上清液作病毒鉴定用。 若接种后7d仍未见CPE，则判断为阴性结果。 若7d内出现可疑CPE现象，则需将该瓶细胞培养液作为接种材料再接种一次，以判断是否有CPE。
7、 3.2.2 病毒鉴定 3.2.2.1 中和试验（固定血清用量稀释病毒法） 本试验用于鉴定在细胞培养中出现了CPE的样品是否为IPNV。 3.2.2.1.1 试验准备 a. 细胞 RTG-2细胞培养于96孔微量细胞培养板上。 b. 病毒 用标准IPNV毒株，传代后制成病毒悬液。 c. 标准抗血清 抗IPNV的标准血清，使用前于56灭活60min。 d. 待检样品（出现了CPE的细胞培养物）冻融一次，除去细胞碎片后使用。 3.2.2.1.2 操作步骤 3.2.2.1.2.1 将待检样品用Hanks液作系列稀释，使其稀释度由10-1到10-3，每管含量为0.5mL。 3.2.2.1.2.2 取两排
8、试管，分别从上述各稀释度的待检样品中取出0.2mL于两排试管中，然后第一排管加入0.2mL抗IPNV标准血清，第二排管加入0.2mL维持液，充分混合均匀。 3.2.2.1.2.3 30温育60min。 3.2.2.1.2.4 温育后分别将第一排管与第二排管的样品接种于已长满RTG-2细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度4孔，每孔0.1mL。 3.2.2.1.2.5 将抗IPNV标准血清倍比稀释后（18至164）接种于上述培养板，每个稀释度4孔，每 孔0.05mL，作为标准抗血清对照。将标准IPNV接种8孔，每孔0.05mL，作为病毒对照，其余8孔作为正 常细胞对照。 3.2.2.1.2.
9、6 各孔加入维持液至总量0.2mL。 页码，3/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm3.2.2.1.2.7 放入20培养箱中培养，逐日观察病变，记录结果（按表1填写）。 表 1 中和试验I结果记录表 3.2.2.1.3 结果判定 按Reed和Muench法分别计算出待检样品-标准血清与待检样品-维持液的细胞半数致死量（TCID50），二者的滴度指数之差的反对数即为中和指数。若正常细胞与标准血清对照为阴性，标准毒对照为阳性，按表2判定结果。 表 2 行 列 待检样品标准 血清 待检样品维持液 标准
10、血清 IPNV对照 细胞对照1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A10-118B10-2C10-3116D10-4E10-5132F10-6G10-7164H10-8中和指数 结 果 判 定10 阴性（待检者不带毒）1050 可疑50 阳性页码，4/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm3.2.2.2 中和试验（固定病毒-稀释血清法） 本试验用于鉴定鱼血清中是否含有抗IPNV的中和抗体。 3.2.2.2.1 试验准备 a. 细胞 RTG-2细胞培养于96孔微量细胞培养板上。 b.
11、病毒 标准IPNV，使用前用Hanks液稀释至50TCID50/0.1mL。c. 血清 待检血清和正常血清（阴性血清）用等量的Hanks液（每毫升含青霉素200IU、链霉素200mg）稀释后，于45灭活30min，待冷却后使用。 3.2.2.2.2 操作步骤 3.2.2.2.2.1 将已灭活处理的待检血清，用Hanks液作系列倍比稀释，使其稀释度由14到1256，每管含量为0.2mL。 3.2.2.2.2.2 分别在上述各管中加入0.2mL（即为待检血清等量）的50TCID50/0.1mL的IPNV悬液，充分摇匀混合。 3.2.2.2.2.3 于30温育60min。 3.2.2.2.2.4 取
12、出后分别接种于长满RTG-2细胞单层的96孔微量细胞培养板，每个稀释度4孔，每孔0.1mL。 3.2.2.2.2.5 按上述步骤设立正常血清对照；将标准IPNV悬液连续10倍稀释后（10-110-7）接种上述培养板，每稀释度4孔，每孔0.1mL，作病毒悬液毒力滴度对照；96孔微量细胞培养板H排12孔作为正常细胞对照。 3.2.2.2.2.6 各孔加入细胞维持液至总量0.2mL。 3.2.2.2.2.7 放入20培养箱培养，逐日观察病变，记录结果（按表3填写）。 表 3 中和试验结果记录表 行 列 待检血清 正常血清对照 病毒滴度对照1 2 3 4 5 6 7 89 10 11 12A 14B
13、1810-1C 116 10-2D 132 10-3页码，5/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm3.2.2.2.3 结果判定 根据病变用Reed-Muench法或Karber法计算出血清中抗体效价（即能保护50的细胞培养孔不产生病变的最高血清稀释度）。血清中和抗体效价大于或等于116者为阳性，小于116者为阴性。 3.3 综合判定 a. 若出现上述临床症状，经细胞培养又出现CPE，并经中和试验为阳性者可判定患有传染性胰坏死病。 b. 若无临床症状，但经细胞培养出现CPE，并经中和试验为阳性者判
14、定为IPNV携带者。 c. 若中和试验为可疑，则判定为可疑。 d. 若无临床症状，经细胞培养也不出现CPE，但鱼血清中抗IPNV中和抗体为阳性者，则判定在近期内患过传染性胰坏死病。 e. 若仅有临床症状，或仅能在细胞培养中出现CPE，但不能被抗IPN中和抗体中和者则不能称患有IPN，需进一步作其他病检查。 4 传染性造血器官坏死病 （Infectious Hematopoietic Neorosis，简称IHN） 该病病原属弹状病毒。 本病流行于美国、加拿大和日本。 主要危害虹鳟、红点马苏大马哈鱼等鲑鳟鱼类的稚鱼，一龄鱼亦有感染的情况。水温15以上鱼呈无症状带毒状态，鱼卵也可带毒。 4.1 临
15、床检查 4.1.1 活动情况 病鱼最初游动迟缓，无力地随水漂浮着，接着顺水流摇晃地游着，虽有痉挛似地动作，但不久就上浮，横着身子而且时常急剧地游泳，不久就死亡。这期间所见狂奔动作为本病的一个特征。 4.1.2 外部检查 病鱼体色暗黑，肛门通常拖着一条半透明的粪便，亦是该病的一个特征。腹部有腹水且肿胀，眼球突出。贫血，鳃显著褪色。从胸鳍基部、背鳍一直到前部，以及肛门附近的躯干E 16410-4F 112810-5G 125610-6H 细胞对照10-7页码，6/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm
16、肌肉常有出血现象，口腔壁亦有出血点。具有卵黄的仔鱼卵黄囊出血，内充满浆液而肿胀。 4.1.3 剖检 脾、肾坏死，脾脏和幽门垂四周的脂肪组织、腹膜、脑和围心膜等处常有出血点，肠道也有出血现象。 4.2 实验室检验 4.2.1 病毒分离 4.2.1.1 细胞准备 同3.2.1.1条，不同的是传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）除可用 CHSE-214细胞分离外，最适分离病毒细胞是FHM，培养温度28。 4.2.1.2 样品接种 同3.2.1.2条。 4.2.1.3 病毒培养 IHNV培养温度是15，在培养过程中每日观察细胞变化情况，观察7d结束。 4.2.1.4 结果观察 若接种样品含有病毒，则3
17、5d后出现CPE，细胞聚集成族，似葡萄样，然后崩解。 若出现CPE，则冻融一次后，低速离心除去细胞碎片，上清液作病毒鉴定。 若7d内无CPE，则为阴性结果。 若7d出现可疑CPE现象，则将该瓶培养液作接种材料再接种一次，以判断是否有CPE。 4.2.2 病毒鉴定 同3.2.2，不同的是用IHN标准毒和IHN标准抗血清。用FHM或CHSE细胞，病毒培养温度是15。 4.3 综合判定 同3.3条。 5 病毒性出血性败血病 （Viral Hemorrhagic Septicemia，简称VHS） 该病病原属弹状病毒。 本病是欧洲地方病。 主要危害虹鳟全长5cm左右的稚鱼到体重200300g左右食用鱼
18、。症状分三型：急性型见流行早期，症状发展很快，死亡率高。慢性型在流行初期以后可见，症状发展慢，鱼体各部的出血不象急性型那样显著，死亡率低。神经型见流行末期。 页码，7/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm5.1 临床检查 5.1.1 活动情况 流行后期病鱼有时在水里扭转游动，有时侧游，有时又突然向前猛烈游动。 5.1.2 外部检查 病鱼体色暗黑，眼球突出，腹部膨胀，贫血，鳃、鳍基部、眼和眼眶等处出血。 5.1.3 剖检 肌肉、内脏脂肪组织、鳔和肠等处出血，以急性型显著。神经型看不出特异的病变。
19、5.2 实验室检验 5.2.1 病毒分离 5.2.1.1 细胞准备 同3.2.1.1。VHS用RTG-2细胞分离。 5.2.1.2 样品接种 同3.2.1.2条。但一般不抽取血清样品作抗体检测，因鱼血清抗VHSV中和抗体是补体依赖型，在无补体情况下检测不出中和抗体。 5.2.1.3 病毒培养 置15培养，在培养过程中每日观察细胞变化情况，观察7d结束。 5.2.1.4 结果观察 若接种材料含有病毒，RTG-2细胞在pH7.6的条件下，24d后出现CPE，细胞缩短，然后变成球形，不久就坏死从瓶壁脱落。 若出现CPE，则冻融一次后，低速离心除掉细胞碎片，上清液作病毒鉴定。 若7d内无CPE，则为阴
20、性结果。 若7d内出现可疑CPE，则将该瓶细胞培养液作为接种材料再接种一次，以判断是否有CPE。 5.2.2 病毒鉴定 对于VHS鉴定，仅对在细胞培养中出现了CPE的样品鉴定是否为VHS病毒，其方法同3.2.2.1。抗血清改为抗VHS的标准血清。用RTG-2细胞，病毒培养温度是15。 5.3 综合判定 a. 若出现上述临床症状，经细胞培养又出现CPE，并经中和试验为阳性者可判定患有病毒性出血性败血症。 页码，8/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm b. 若无临床症状，但经细胞培养出现CPE，并
21、经中和试验为阳性者则判定为VHS病毒携带者。 c. 若中和试验为可疑，则判定为可疑。 d. 若仅有临床症状，或仅能在组织培养中出现CPE，但不能被抗VHS血清所中和者，不能称患有VHS，需进一步作其他病检查。 6 斑点叉尾病毒病 （Channel Catfish Virus Disease，简称CCVD） 该病病原属疱疹病毒。 本病流行于美国。 对鱼龄8个月内的斑点叉尾是一种急性传染病，死亡率可达100。鱼龄8个月以上的则呈带毒状态。 6.1 临床检查 6.1.1 活动情况 病鱼游泳异常，又旋转、又抽搐，不久便沉入水底，接着垂直地浮于水面，最终死亡。 6.1.2 外部检查 病鱼眼球突出，鳃显著
22、褪色。皮肤和鳍有出血现象。晚期病鱼一般腹部膨胀，肛门突出。 6.1.3 剖检 胃扩张，内有粘液状液体。肌肉、肾、肝、脾等处可见出血。 6.2 实验室检验 6.2.1 病毒分离 6.2.1.1 细胞准备 同3.2.1.1条，不同的是CCVD病毒用BB细胞分离，最适培养温度是2530。 6.2.1.2 样品接种 同3.2.1.2条。 6.2.1.3 病毒培养 CCVD病毒培养温度25，在培养过程中每日观察细胞变化情况，观察7d 结束。 6.2.1.4 结果观察 若接种材料中含有病毒，则13d内即可出现CPE，开始出现合胞体，继而细胞崩解。出现CPE的细胞上清液可作病毒鉴定。 页码，9/19GB/T
23、 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm 7d内无CPE为阴性结果。 若7d内出现可疑CPE现象，则将该瓶细胞培养液作为接种材料再接种一次，以判断是否有CPE。 6.2.2 病毒鉴定 同3.2.2条。用CCVD标准毒和CCVD的标准抗血清。用BB细胞，病毒培养温度是25。 6.3 综合判定 同3.3条。 7 鲤春病毒病 （Spring Viremia of Carp，简称SVC） 该病病原属弹状病毒。 本病流行于欧洲。 危害一龄以上的鲤鱼。 7.1 临床检查 7.1.1 活动情况 病鱼集中在进水口，虽进行缓慢地
24、呼吸，但不久便沉入水底。 7.1.2 外部检查 病鱼体色暗黑，眼球突出，腹部膨胀，肛门发红，肿胀。鳃有出血点。 7.1.3 剖检 打开体腔，有腹水。肠道有严重炎症。几乎所有内脏都有出血点，鳔壁是最常见的部位，肌肉亦由于出血而发红。脾脏显著肿大。亦可见黄胆症状。此外也可见内脏诸器官水肿。 7.2 实验室检验 7.2.1 病毒分离 7.2.1.1 细胞准备 同3.2.1.1条。SVC病毒用FHM细胞分离。 7.2.1.2 样品接种 同3.2.1.2条。但一般不取鱼卵作病毒分离。 7.2.1.3 病毒培养 SVC病毒最适培养温度是2022，在培养过程中，每日观察细胞变化情况，观察7d结页码，10/1
25、9GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm束。 7.2.1.4 结果观察 若接种材料含有病毒，则24d内可出现CPE，特征为细胞变圆，继而崩解脱落。 其他同3.2.1.4条。 7.2.2 病毒鉴定 同3.2.2条。用SVC标准毒和抗SVC的标准抗血清。用FHM细胞，病毒培养温度是2022。 7.3 综合判定 同3.3条。 8 疖疮病 （Furunculosis） 该病病原是灭鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）。 本病流行于欧洲、美国、加拿大和日本等国，流行范围较广。 主要危害鲑科高
26、龄鱼。一般分三型：急性型，病鱼急性死亡，外部无症状；亚急性型，病情发展较慢，在躯干肌肉形成感染病灶疖疮；慢性型，病鱼长期处于带菌状态。 8.1 临床检查 8.1.1 活动情况 病鱼离群独游，活动缓慢。 8.1.2 外部检查 病鱼体色暗黑，躯干部有膨隆或溃疡患处。鳍基部充血，通常鳃部亦多数有出血点。 8.1.3 剖检 肠道充血发炎，肾脏软化、肿大，脾脏亦肿大，多呈淡红色，也有暗红色，肝脏一般褪色，脂肪增多。 8.2 实验室检验 8.2.1 细菌检查 8.2.1.1 细菌检查原理 灭鲑气单胞菌在PBG培养基上生长并形成黄色菌落；在FA 培养基上生长良好，产生褐色水溶性色素；菌体不运动；大多数菌株V
27、-P反应阴性。利用这些特性可以检查灭鲑气单胞菌的存在。 8.2.1.2 准备 页码，11/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm a. 设备和器械 显微镜（具油镜、暗视野）、恒温箱、接种环、培养皿等。 b. 培养基和试剂 PBG培养基、2琼脂、FA培养斜面、葡萄糖蛋白胨水、革兰氏染色液I、-P试剂配制方法见附录B（补充件）。 8.2.1.3 检验 8.2.1.3.1 用解剖刀切开躯干疑为疖疮的患部（坏死组织已外露时不必切开）。用干净的载玻片紧贴病灶并挤压，取下载玻片后滴加12滴无菌水至载玻片上，盖
28、好盖玻片，用400600倍暗视野显微镜观察菌体运动与否及菌体形态。 8.2.1.3.2 可用锥子或解剖针刺穿头骨，破坏小脑，使鱼失去运动能力，再用酒精棉球擦净、消毒被检鱼体表，在肛门前面0.5cm处用无菌剪刀剪开腹部，然后从此处沿一侧向背部逐步转向头部剪成弧形，打开腹腔，露出肾脏。 8.2.1.3.3 取肾脏0.5g放入无菌培养皿内，用无菌玻棒磨碎肾脏，再倾入4548的PBG培养基15mL与之混合均匀，待凝固稍干后加入452琼脂覆盖，琼脂凝固后把培养皿倒置在25培养箱内培养48h。 8.2.1.3.4 用接种环刺破PBG培养皿表面的琼脂层。挑起菌落接种到FA斜面上，置22恒温箱中培养72h，观
29、察有无水溶性褐色色素产生。每个培养皿出现3个以上黄色菌落时选取3个，3个以下时全部接至FA斜面，每个菌落分别接种一支斜面。 8.2.1.3.5 选厚薄在1.01.2mm的干净载玻片一块，滴12滴无菌水至载玻片上，用接种环挑取在FA斜面上培养1324h的细菌少许涂抹在水滴中，加盖玻片用400600倍暗视野显微镜观察是否运动。 另取一干净载玻片，滴12滴无菌水，用接种环挑取同一斜面上的菌苔少许涂片，干燥后在火焰上通过三次固定。革兰氏染色液液染1min，液染2min。液脱色至酒精刚刚不出现紫色为止，液染12min。用油镜观察染色特性和形态。 8.2.1.3.6 V-P试验。用接种环从FA斜面上挑取培
30、养1824h菌苔少许接种到葡萄糖蛋白胨水中，置25培养72h后加入与培养液等量的V-P试剂，放回25保温6h后观察。 8.2.1.3.7 检验项目按下列规则免检。 躯干若无肉眼可见疖疮病灶则不做8.2.1.3.1检验。 在8.2.1.3.1中，检出不运动短杆菌时不做8.2.1.3.28.2.1.3.6检验。 在8.2.1.3.3的检验中，PBG培养皿上没有菌落或没有出现黄色菌落时不做8.2.1.3.48.2.1.3.6检验。 8.2.1.4 结果观察 a. 菌体运动和形态的观察。观察菌体运动的载玻片上的水不能干涸。在暗视野中，菌体活动范围超过视野的1/4，称为具运动性，菌体原地作布朗运动不能称
31、为运动或具运动性。 页码，12/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm 革兰氏染色后，显微镜下看到红色菌体为革兰氏阴性细菌。细菌呈紫色为阳性细菌，菌体颜色不易辨别时，应重新检查一次染色特性，革兰氏染色的灭鲑产气单胞菌，菌体大约为0.81.2 m1.01.8 m称短杆菌。 b. 在PBG培养皿上出现的黄色菌落有大有小，均按黄色菌落处理，转接FA斜面时选取较小的菌落，当没有出现菌落或不是黄色菌落时即认定没有疖疮病。 c. 在FA斜面上有褐色色素渗入培养基中时为产生水溶性褐色色素，仅菌苔有色素而未渗入培
32、养基中不算作产生水溶性色素。 d. V-P试验，加入V-P试剂后6h观察，红色为阳性，黄色为阴性。 8.3 综合判定 a. 临床检查发现鱼体躯干一处（少数鱼可能多处）有红肿、隆起或局部软化，组织坏死等明显病灶，并检出不运动短杆菌即可判定为疖疮病。 b. 凡检出肾脏有细菌，细菌在PBG培养皿上呈黄色菌落，菌体为革兰氏阴性短杆菌，不运动，在FA斜面上产生水溶性褐色色素，V-P试验阴性，无论有无肉眼可见病症都可判定为疖疮症。 9 弧菌病 （Vibriosis） 该病病原菌大多数是鳗弧菌（Vibrio anguillarum）。 本病流行于欧洲、美国、加拿大和日本等国。 弧菌属细菌对淡水鱼、半咸水鱼、
33、海水鱼均有一定的致病力，危害多种鱼类，如鲑科鱼类、香鱼、鳗鲡等。 9.1 临床检查 9.1.1 活动情况 病鱼活动迟钝，在池边和水面缓慢游动。 9.1.2 外部检查 鱼的种类不同出现的症状有差异。 a. 虹鳟：在躯干的任一部位的皮下或肌肉形成一个比较大的类似疖疮的溃疡，形状不规则，伴有出血，其他地方肌肉也常有出血点。眼球突出，鳃、眼球以及各鳍也出血，肛门发红，往往混有血液的粘液流出。 b. 鳗鲡：皮肤点状出血、发红。腹部、下颚和各鳍最为明显，尤以胸鳍严重，往往坏死糜烂。 c. 香鱼：在躯干任一部位的肌肉内出现一个半透明的白斑，溃疡患部同时伴有出血。 9.1.3 剖检 剖检弧菌病病鱼可见到下列症
34、状的全部或部分。 页码，13/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm 肠有炎症，肠管充血或出血，内有黄褐色粘液物，肠内壁有肉眼可见的溃疡。 肝脏瘀血、肿大、有出血点或出血斑。 9.2 实验室检验 9.2.1 细菌检查 9.2.1.1 准备 a. 设备和器械 同8.2.1.2中a。 b. 培养基和试剂 TYE培养基、糖发酵培养基、革兰氏染色液、1溴麝香草酚蓝酒精溶液、1 -萘酚酒精溶液、1盐酸二甲基对苯撑二胺水溶液、弧菌抑制素0/129试纸片、 310过氧化氢溶液配制方法见附录C（补充件）。 9.2
35、.1.2 检验 9.2.1.2.1 取样：病鱼体表溃疡已深入真皮层时，一般直接用接种环从患部取样在TYE平皿上划线。体表无溃疡或体表浅溃疡时，可以无菌操作打开腹腔剪下一块肝脏或肾脏组织至TYE平皿上，用接种环压一下组织块再在平皿上划线。 9.2.1.2.2 倒置划线的平皿，25恒温箱培养24h后，挑选单个菌落转接至TYE斜面上。 9.2.1.2.3 取TYE斜面上25培养1824h的菌苔作下列检验： a. 菌体运动性、染色特性和形态的观察。 具体操作见8.2.1.3.5。 b. 糖发酵试验。用接种环挑取菌苔少许接至糖发酵培养基中，于25，经24h后观察。 c. 氧化酶试验。在干净的培养皿中放一
36、张滤纸，滴少许1二甲基对苯撑二胺水溶液，使滤纸湿润，再滴加约等量的1 -萘酚溶液，用铂金接种环或玻璃棒或木棒（不能用含铁的铬钼丝接种环）挑取少许菌苔在滤纸上涂抹。 d. 过氧化氢酶试验。用接种环挑取一环菌苔涂于干净载玻片上，然后滴加一滴310过氧化氢溶液。 e. 用接种环挑取菌苔在TYE平皿上均匀涂布，再把浸过弧菌抑制素0/129的小圆试纸片贴在涂布区的中央，倒置平皿，于25经1824h后观察。 9.2.1.3 结果观察 a. 仔细察看细菌在TYE平皿上的菌落的颜色、形态、光泽、菌体运动情况，菌体形态及革兰氏染色特性，并作好记录。 b. 糖发酵培养24h后的培养基由蓝色变为黄色是阳性，表明利用
37、葡萄糖。小套管中有气页码，14/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm体为产气，小套管中充满培养基无气体为不产气。 c. 滤纸上涂抹菌苔后10s内变为蓝色者为阳性，1060s内变为蓝色者为迟缓反应，60s以上出现蓝色者为阴性。 滴加过氧化氢后有小气泡冒出为过氧化氢酶阳性，不冒气泡者为阴性。 d. 试纸片周围一圈无细菌生长为敏感（即阳性），有细菌生长为不敏感。 9.3 综合判定 a. 发现鱼群中有病鱼皮肤出现溃疡，体表有出血点或出血斑，剖检发现肠管有炎症或肝脏瘀血等症状应拟为弧菌病。 b. 凡从体表
38、溃疡部或肝肾检出的细菌具有下列特性判定为弧菌病。 在TYE平皿上菌落灰白至淡黄褐色，半透明，正圆隆起，周缘光滑，有光泽。菌体为革兰氏阴性短杆菌，直或稍弯曲，发酵葡萄糖，但不产气。氧化酶阳性，过氧化氢酶阳性，对弧菌抑制素0129敏感。 10 昏眩病 （Whirling Disease） 该病病原体为脑粘体虫（Myxosoma cerebralis）。 本病流行于欧洲、美国、加拿大、新西兰、南美和非洲一些国家，流行范围很广。 主要是鲑鳟鱼类的疾病。 10.1 临床症状 28月龄的病鱼，尾部露出水面作旋转运动狂游，旋转角度达180360。尾部呈黑色。 昏眩病后期鳃盖骨萎缩，鳃裸露在外，下颌骨畸形，脊
39、椎弯曲，眼后头盖骨严重凹陷，这种鱼三年后尚带有病原体。 10.2 寄生虫检查 10.2.1 采样 选择有临床症状的鱼作寄生虫检查，若无症状，可根据鱼的数量抽样检查。1 000尾以下抽检4尾， 1000尾以上抽检510尾。 10.2.2 检查方法 脑粘体虫的孢子大小为6.57 m7.58 m，壳面观呈椭圆形至圆形，有两个梨形极囊，孢质中有两个圆形的胚核，无嗜碘泡，感染后三个月左右形成胞囊。 10.2.2.1 将头部纵切开，观察耳区软骨组织中有无胞囊（乳白色，直径为12mm），若有胞囊，取一小块胞囊放在载玻片上，压碎，用450600倍显微镜检查，可见到大量脑粘体虫孢子。 页码，15/19GB/T
40、15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm10.2.2.2 如果没有发现胞囊，则从耳石区将软骨组织切开，刮取内含物作涂片镜检。左右耳石区都需检查。 10.2.2.3 上述两项检查都未发现孢子，可将鱼的头部割下，并纵切开。放在高速搅拌器内或研钵内，加入20mL蒸馏水，充分搅拌后，取2滴水，放在载玻片上镜检。 10.2.2.4 孵化后3d的鲑、鳟鱼类就可能感染昏眩病。对于未形成胞囊的病鱼，通过头部软骨组织的病理切片能观察到脑粘体虫的营养体。病理切片按常规切片方法，苏木精、曙红染色。 10.3 综合判定 a. 出现上述临
41、床症状，又检查到脑粘体虫的孢子或营养体，则判定为昏眩病。 b. 未出现上述临床症状，但检查到脑粘体虫营养体或孢子，则判定为昏眩病。 附 录 A 细胞生长液等配制方法 （补充件） A1 细胞生长液 称取9.4g Eagle MEM“Nissui”溶于1 000mL双蒸水中，103.421MPa高压蒸汽灭菌15min，冷却后，在无菌室内，加过滤灭菌的谷氨酰胺0.3g，用10mL的7.5碳酸氢钠调节pH值为7.27.4，然后分装备用，用前再加10小牛血清。 注：日本制药株式会社。 A2 细胞维持液 含35的小牛血清细胞生长液为细胞维持液。 A3 胰酶-EDTA混合消化液 过滤除菌后分装备用。 A4
42、磷酸缓冲盐水（PBS） 氯化钠（Nacl，分析纯） 0.8g氯化钾（KCL，分析纯） 0.02g磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）0.02g磷酸氢二钠（Na2HPO4，分析纯）0.115g乙二胺四乙酸（EDTA，分析纯） 0.02g胰酶（分析纯） 0.1g双蒸水 100mL页码，16/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm 103.421 MPa，15min高压灭菌，或过滤除菌，普通冰箱保存备用。 A5 7.5碳酸氢钠 称取碳酸氢钠7.5g（分析纯或化学纯）溶于100mL双蒸水中，然后密封高压灭菌
43、（103.421MPa，15min）或过滤除菌。 附 录 B 疖疮病细菌培养基等溶液的配制方法 （补充件） B1 PBG培养基 上述各成分混合、加热溶解，用10氢氧化钠溶液校正pH值为7.27.5，装瓶，在68.947MPa压力下高压灭菌20min。 B2 2琼脂 溶解后装瓶，103.421MPa，30min高压灭菌。 B3 FA培养斜面 氯化钠（NaCl，分析纯） 8.0g氯化钾（KCl，分析纯） 0.2g氯化钙（CaCL2，分析纯）0.1g氯化镁（MgCl26H2O，分析纯）0.1g磷酸氢二钠（Na2HPO42H2O，分析纯）1.15g磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）0.2g双蒸水 1
44、000mL蛋白胨（生化试剂） 10g糖原（生化试剂） 4g氯化钠（分析纯） 5g肉浸汁（生化试剂） 10g十二烷基磺酸钠（化学纯） 0.1g溴百里酚蓝 0.1g琼脂（医用） 15g蒸馏水 1 000mL琼脂（医用） 20g蒸馏水 1 000mL酪蛋白（生化试剂） 7g酵母膏（生化试剂） 3g页码，17/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm 上述各成分混合、加热溶解，用10氢氧化钠溶液校正pH值为7.3，103.421MPa，30min高压灭菌后放成斜面，备用。 B4 葡萄糖蛋白胨水 混合各成分，
45、加热溶解，用10氢氧化钠校正pH值为7.6，分装试管，在55.157 6MPa压力下灭菌20min，备用。 B5 革兰氏染色液：结晶紫酒精饱和液20mL，1草酸铵水溶液80mL混合。 革兰氏染色液：碘1g，碘化钾2g溶解在300mL蒸馏水中。 革兰氏染色液：95酒精（医用）。 革兰氏染色液：2.5沙黄酒精溶液10mL，加蒸馏水90mL。 B6 V-P试剂 上述各成分混合溶解。 附 录 C 弧菌病细菌培养基等溶液的配制方法 （补充件） C1 TYE培养基 上述成分混合加热溶解，用10氢氧化钠校正pH值为7.27.4，一部分在103.421MPa压力下灭菌30min后，冷却至45左右倾注培养皿做成
46、培养平皿，另一部分分装试管，103.421MPa，30min高压灭菌后放成斜面。 氯化钠（分析纯） 2.5g琼脂（医用） 15g蒸馏水 1 000mL葡萄糖（分析纯） 1g蛋白胨（生化试剂） 1g氯化钠（分析纯） 0.5g蒸馏水 100mL硫酸铜（CuSO45H2O，分析纯）1g氨水（ =0.9） 40mL氢氧化钾溶液（10） 160mL蛋白胨 10g 酵母膏 5g氯化钠 5g 蒸馏水 1 000mL琼脂（医用） 18g页码，18/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htmC2 糖发酵培养基 先将蛋白
47、胨、氯化钠加入水中加热溶解，然后加入葡萄糖，冷却后用10氢氧化钠校正pH值为7.6，再加入1溴麝香草酚蓝溶液0.4mL，分装试管每试管中倒置一小套管。55.157 6MPa，30min灭菌备用。 C3 革兰氏染色液 同附录B（补充件）中B5。 C4 1溴麝香草酚蓝酒精溶液 溴麝香草酚蓝1g溶于99mL95的酒精中。 C5 1 -萘酚酒精溶液 -萘酚1g溶于99mL95的酒精中。 C6 1盐酸二甲基对苯撑二胺水溶液 盐酸二甲基对苯撑二胺1g溶于99mL蒸馏水中。 C7 弧菌抑制素0/129试纸片 二氨基二异丙基喋啶（2.4-Diamino-6.7-diisopropy pteridine）80mg溶于10mL无水酒精中，取其1mL加入200片直径6mm的灭菌滤纸片中，使其充分吸收，37烘干备用（即每纸片含弧菌抑制素0/129 40 g）。 C8 310过氧化氢溶液 取分析纯过氧化氢用蒸馏水稀释至310。 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g葡萄糖 1g 蒸馏水 100mL页码，19/19GB/T 15805.119952006-3-29file:/C:InetpubwwwrootdatagbgG15805aa.htm
