1、ICS 11. 100 C 30 中华人民圭t./、道昌和国国家标准GB/T 16175-2008 代替GB/T16175-1996 医用有机硅材料生物学评价试验方法Biological evaluation test methods for medical organic silicon materials 2008-01-22发布:丁丁中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局户:罗/中国国家标准化管理委员会2008-09-01实施发布G/T 16175-2008 目次前言引言. II l 范围-2 规范性引用文件.3 评价与试验选择4 样品制备5 细胞毒性试验.6 迟发型超敏反应试验.7 剌
2、激试验8 急性全身毒性试验.7 9 亚急性(亚慢性和慢性全身毒性试验810 热原试验11 遗传毒性试验.12 12 植入试验. . 21 13 溶血试验23附录A(资料性附录)细胞培养常用溶液和培养基制备.25 附录B(资料性附录)遗传毒性试验用试剂制备.27参考文献.31 GB/T 16175-2008 前言本标准代替GB/T16175-1996(医用有机硅材料生物学评价试验方法。本次修订按GB/T16886 医疗器械生物学评价对标准内容进行了修改和调整。本标准与GB/T16175-1996的主要差异如下z一一增加了规范性引用文件;一一试验选择指南改为评价与试验选择，取消了试验选择表;一-修
3、改了材料浸提液制备方法，取消了供试品表面积或重量与浸提介质比例表;一一修改了细胞毒性试验，包括浸提液和直接接触试验;一一一过敏试验修改为迟发型超敏反应试验，增加了封闭贴敷迟发型超敏反应试验;一将皮内剌激试验、原发性皮肤剌激试验和眼剌激试验整合为剌激试验，包括皮肤剌激试验、眼剌激试验和皮内反应试验。取消了口腔黠膜剌激试验;-一增加了亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性试验;一一增加了遗传毒性试验，包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)、小鼠淋巴瘤细胞突变试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;一一修改了植入试验，增加了皮下和骨植入试验;-一-增加了附录B遗传毒性试验用试剂制备。本标准的附录A和附
4、录B为资料性附录。本标准由国家食品药品监督管理局提出。本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会归口。本标准起草单位:国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、上海生物材料研究测试中心。本标准主要起草人:由少华、孙胶、朱雪涛、黄肯讳、黄经春、王昕、侯丽、曾冬明。本标准于1996年3月首次发布。I GB/T 16175-2008 引本标准给出的试验方法是根据GB/T16886. 1(医疗器械生物学评价第1部分z评价与试验的基本原则，特别针对医用有机硅材料的生物学评价需求所设立的。本次修订是在GB/T16886(医疗器械生物学评价标准和中华人民共和国药典)(以下简称中国药典)二部中相
5、应试验方法学原理和试验步骤的基础上，并根据医用有机硅材料的特性制定而成，因此本标准是与GB/T16886标准和中国药典方法具有方法学等同性、适用于医用有机硅材料生物学评价的方法标准。本次修订对热原试验直接引用中国药典中的适用章节;对GB/T16886标准中未给出详细试验步骤的试验项目进行了细化，例如细胞毒性、急性全身毒性、亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性、遗传毒性和植入试验;对GB/T16886标准中己详细给出试验步骤的剌激、迟发型超敏反应试验，本次修订采用直接引用相应GB/T16886标准的方式。鉴于亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性、遗传毒性试验均为发展中的生物学试验，本标准给出的试验方法并非为
6、唯一的方法，任何经确认符合GB/T16886标准基本试验原理且适用于医用有机硅材料的试验方法均可视为与本标准具有方法学等同性。E 医用有机硅材料生物学评价试验方法1 范围本标准规定了医用有机硅材料的生物学评价试验方法。本标准适用于医用有机硅材料的生物学评价。2 规范性引用文件GB/T 16175-2008 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 16886. 1 医疗器械生物
7、学评价第1部分:评价与试验(GB/T16886. 1-2001, idt ISO 10993-1: 1997) GB/T 16886. 3 医疗器械生物学评价第3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验(GB/T 16886.3-1997,idt ISO 10993-3:1992) GB/T 16886.5 医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验(GB/T16886. 5一2003，idt ISO 10993-5: 1999) GB/T 16886. 6 医疗器械生物学评价第6部分:植入后局部反应试验(GB/T16886.6-1997, idt ISO 10993-6: 1994) GB/T
8、 16886.10 医疗器械生物学评价第10部分:剌激与迟发型超敏反应试验(GB/T 16886.10-2005,ISO 10993-10:2002 ,IDT) GB/T 16886. 11 医疗器械生物学评价第11部分:全身毒性试验(GB/T16886. 11一1997，idt ISO 10993-11: 1993) GB/T 16886. 12 医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品(GB/T16886. 12-2005 ,ISO 10993-12: 2002 , IDT) 中华人民共和国药典(二部3 评价与试验选择3. 1 总则医用有机硅材料按其预期与人体接触的性质和接触时间按
9、照GB/T16886.1规定的基本原则进行生物学评价。3.2 试验选择GB/T 16886. 1中给出了应考虑的评价试验。对于可能影响机体生殖功能的材料，应补充做生殖和发育毒性试验。4 样晶制备4. 1 总则试验与对照样品制备应按GB/T16886. 12的要求进行。如果试验方案要求使用试验材料的浸提液，所用浸提介质和浸提条件应与最终产品的特性和使用以及试验目的相适应。在选择浸提条件时应考虑试验材料的理化特性、可溶出物或残留物。1 GB/T 16175-2008 4.2 浸提条件如需制备浸提液，材料与浸提介质比例按GB/T16886.12的规定。常规浸提条件见表L表1常规浸提条件浸提温度FC浸
10、提时间/h37土124士237土172土250士272士270土224士2121士21士0.1注:(37土l)C浸提(24士2)h一般仅用于浸提介质为含血清细胞培养基时。5 细胞毒性试验5. 1 方法提要浸提设备电热恒温培养箱电热恒温培养箱电热恒温培养箱电热恒温干燥箱电热蒸汽灭菌器本试验系将试验样品接触培养细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价试验材料对体外细胞的毒性作用。注也可采用其他等效的符合GB/T16886.5要求的细胞毒性试验。5.2 试剂氯化锅、氯化何、氯化钙、硫酸镜、磷酸氢二锅、磷酸二氢饵、氢氧化铺、葡萄糖、酣红、台盼蓝、乙二胶四乙酸二锅(EDTA)、膜蛋白酶、Eagl
11、e培养基、RPMI1640培养基、胎(小牛血清、青霉素G(铀盐)、硫酸链霉素、乙醇、苯醋、二甲基亚枫(DMSO)。5.3 主要设备和用具超净工作台、CO2培养箱、恒温水浴箱、电冰箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器、抽滤瓶、磁力搅拌器、培养板(皿、液氮罐或超低温冰箱、天平。5.4 细胞株试验用细胞株可采用ATCCCCL lNCTC clone 929(小鼠成纤维细胞)J或其他适宜细胞。试验采用传代48h72 h生长旺盛的细胞。5.5 试验前准备5.5.1 器具灭菌与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121C30 min.或置电热干燥箱内160C2 h。5.
12、5.2 无菌室要求元菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。5.5.3 细胞培养基、细胞消化液、平衡盐溶班制备按附录A给出的方法或其他经确认适宜的方法制备。5.5.4 试验样晶制备5.5.4. 1 元菌试验材料直接取样试验。未灭菌试验材料宜采用与成品相同的灭菌过程或其他适宜方法灭菌。5.5.4.2 需制备浸提液时可采用含血清(或无血清)细胞培养基或质量浓度为9g/L的氯化铀注射液为浸提介质，制备方法按GB/T16886. 5的规定。5.5.5 对照晶制备5.5.5. 1 阴性对照品z可采用经确认过的不产生细胞毒性反应的材料，例如高密度聚乙烯。GB/T 16175-20
13、08 5.5.5.2 阳性对照品z可采用经确认过的可重现细胞毒性反应的材料，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯、质量浓度为5g/L的苯酣溶液或体积分数为5%的二甲基亚枫(DMSO)溶液。5.5.5.3 需制备浸提液时同5.5.4.2.5.6 试验步骤5.6. 1 总则根据试验材料特性选择下列试验中的一种或多种适宜方法进行评价。5.6.2 浸提渡试验5.6.2. 1 四睡盐(MTT)比色法将配制好的1X104 /mL细胞悬液接种于96孔培养板，设置空白对照、阴性对照、阳性对照和试验样品组，每组各设至少6孔，每孔接种100L细胞悬液。置CO2培养箱含体积分数5%二氧化碳气体，下同)37C培养24h后，
14、弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照溶液或阳性对照品浸提液，试验样品组加入试验材料浸提液，每孔100L，置CO2培养箱继续培养72儿注:如采用质量浓度为9g/L的氯化锅注射液为浸提介质时，需使用浓缩培养基将浸提液稀释至规定浓度.72 h后，置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20L质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入150LDMSO，置振荡器上振荡10min，在酶标仪570nm和630nm波长下测定吸光度，按式(1)计算相对增殖率:也R=主X100% 式中zRGR一-相对增殖率，%;A试验样品组(阴性、阳性
15、对照组)吸光度;A。一一空白对照组吸光度。. ( 1 ) 根据RGR按表2分级判定。阴性对照组的反应应不大于1级，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。表2细胞毒性反应分级级别相对增殖率/%。二注1001 80-99 2 50-79 3 30-49 4 0-29 5.6.2.2 显微镜观察法将配制好的1X105/mL细胞悬液接种于直径35mm培养皿内，每皿2mL。置CO2培养箱37.C培养至近汇合单层细胞形成。弃去原培养液。阴性对照组加入阴性对照品浸提液，阳性对照组加入阳性对照液或阳性对照品浸提液，试验样品组加入试验材料浸提液，每皿各加2mL。每组平行操作3
16、皿，置CO2培养箱继续培养72 h. 注:如采用质量浓度为9g/L的氯化纳注射液为浸提介质时，需使用浓缩培养基将浸提液稀释到规定浓度。3 GB/T 16175-2008 置显微镜下观察，按表3分级判定。阴性对照组应为0级反应，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。表3细胞毒性反应分组级别反应程度反应观察。元细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗粒;元细胞溶解1 极轻微至多20%的细胞呈圆形，疏松贴壁，元胞浆内颗粒;偶见细胞溶解2 轻度至多50%的细胞呈圆形，无胞浆内颗粒z明显可见细胞溶解和细胞间空区3 中度至多70%的细胞呈圆形或榕解4 重度细胞层几乎完
17、全破坏5.6.3 直接接触试验注2本试验不适宜于极低密度和高密度材料，可能会导致细胞物理性损伤。试验和对照材料应处置成直径为10mm的圆片或表面积约为100mmz，接触细胞面为平面。将配制好的1.5X105 /mL细胞悬液接种于直径35mm培养皿内，每皿2mL。置COZ培养箱37C培养至近汇合单层细胞形成。弃去原培养液，每皿加入2mL新鲜细胞培养基。将试验和阴性对照、阳性对照样品分别轻轻放入培养皿内，每皿放置一片样品，使其沉于皿底与细胞单层直接接触。每组平行操作3皿。置COZ培养箱继续培养48h。置显微镜下观察，按表4分级判定。阴性对照组应为0级反应，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳
18、性对照组反应不成立时应重新试验。表4细胞毒性反应分级级别反应程度反应观察。无样品下面和周围区域细胞无异常迹象1 极轻微样品下面有些细胞出现形态异常或退化迹象2 轻度细胞反应区域局限在样品下方范围或超出样品边缘小于5mm 3 中度细胞反应区域超出样品下方范围5mm-lO mm 4 重度细胞反应区域超出样品下方范围10mm以上5. 7 结果评价在阴性对照和阳性对照产生预期反应的情况下，分析评价试验样品细胞毒性反应程度。5.8 试验报告试验报告中应给出下列信息:a) 试验材料名称zb) 批号:c) 试验和对照样品制备;d) 试验用培养基、细胞株制备ze) 试验步骤;f) 细胞反应和其他情况zg) 观
19、察结果;h) 结果评价。4 6 迟发型超敏反应试验6. 1 方法提要GB/T 16175-2008 本试验包括最大剂量迟发型超敏反应试验和封闭贴敷迟发型超敏反应试验，用以评价试验材料在试验条件下引发迟发型超敏反应的潜在性。6.2 总则最大剂量迟发型超敏反应试验为首选方法。试验样品如不适宜皮内注射或预期用于制造与皮肤接触器械的试验材料可选择封闭贴敷迟发型超敏反应试验。6.3 试剂质量浓度为9g/L的氯化铀注射液、新鲜精制植物油、二硝基氯苯(dinitrochlorobenzene，DNCB)、十二烧基硫酸铀、弗氏完全佐剂。注:本标准各试验中所用新鲜精制植物油推荐采用符合美国药典规定的棉籽汹或芝麻
20、油，也可使用其他经验证证实无生物学毒性反应的植物油。6.4 主要设备和器具压力蒸汽灭菌器、电剃刀、天平、动物天平、注射器、研钵。6.5 试验前准备6.5. 1 器具灭菌与试验和对照样品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121.C30 mino 6.5.2 试验动物准备按GB/T16886. 10的规定。6.5.3 弗氏完全佐荆制备6.5.3. 1 无水羊毛脂与液体石蜡的体积比为4: 6(冬季使用比例为3: 5)。将无水羊毛脂加热榕解后取40r此置研钵中，稍冷却后边研磨边加液体石蜡，直至60mL液体石蜡加完。置压力蒸汽灭菌器内121.C 30 min，即制备成弗氏不完全佐剂，4.C保存备用。6.5
21、.3.2 在弗氏不完全佐剂中按4mg/mL5 mg/mL加人死的或减毒的分枝杆菌(如卡介苗或结核杆菌)，即得弗氏完全佐剂。6.6 最大剂量迟发型超敏反应试验6.6. 1 浸提介质质量浓度为9g/L的氧化锅注射液、新鲜精制植物油。6.6.2 阳性对照样晶质量浓度为1g/L的二硝基氯苯溶液或其他能产生相应阳性反应的液体。6.6.3 试验样晶制备按GB/T16886. 10规定选择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氯化铀注射液和植物油浸提液。6.6.4 试验步骤和结果评价按GB/T16886. 10一2005的7.4进行操作和评价。6. 7 封闭黯敷迟发型超敏反应试验6.7. 1
22、浸提介质质量浓度为9g/L的氧化铀注射液、新鲜精制植物油。6.7.2 阳性对照样晶质量浓度为1g/L的二硝基氯苯溶液或其他能产生相应阳性反应的液体。6.7.3 试验样晶制备按GB/T16886. 10规定制备试验样品。试验材料如不能直接贴敷，应按GB/T16886. 10规定选GB/T 16175-2008 择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氧化铀注射液和植物油浸提液。6.7.4 试验步骤和结果评价按GB/T16886. 10-2005的7.5进行操作和评价。6.8 试验报告试验报告中应给出下列信息za) 试验材料名称pb) 批号;c) 试验和对照样品制备zd) 试验步骤;
23、e) 试验部位观察记录;f) 结果评价。7 剌激试验7. 1 方法提要本试验包括皮肤剌激试验、眼剌激试验和皮内反应试验。皮肤剌激试验适用于评价预期与皮肤接触的材料。眼剌激试验适用于评价预期与眼接触的材料。皮内反应试验系将材料浸提液注入家兔皮内，适用于评价试验材料在试验条件下对接触组织的潜在刺激性。7.2 试剂质量浓度为9g/L的氯化铀注射液、新鲜精制植物油、质量浓度为50g/L的甲醒溶液。7.3 主要设备和器具压力蒸汽灭菌器、检眼镜、天平、动物天平、动物固定器、注射器。7.4 试验前准备7.4. 1 器具灭菌与试验和对照样品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121.C30 mino 7.4.2
24、试验动物准备按GB/T16886.10的规定。7.5 皮肤剌敢试验7.5.1 试验样晶制备按GB/T16886. 10规定制备试验样品。试验材料如不能直接贴敷，应按GB/T16886. 10规定选择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氧化铀注射液和植物油两种浸提液。7.5.2 试验步骤按GB/T16886. 10-2005的6.3进行操作，每次与皮肤接触期为24h。阴性对照采用同批浸提介质，阳性对照采用质量浓度为50g/L的甲醒溶液或其他能产生相应阳性反应的材料。7.5.3 结果评价按GB/T16886. 10-2005的6.3进行评价。7.6 眼剌激试验7.6. 1 试验样晶
25、制备按GB/T16886. 10规定制备试验样品。试验材料如不适宜直接与眼接触，应按GB/T16886. 10 的规定选择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氯化铀注射液和植物油两种浸提液。7.6.2 试验步骤和结果评价按GB/T16886. 10-2005的第B.3章进行操作和评价。6 GB/T 16175-2008 7.7 皮肉反应试验7.7. 1 试验样晶制备按GB/T16886. 10规定选择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氧化铀注射液和植物油两种浸提液。7.7.2 试验步骤和结果评价按GB/T16886.10-2005的B.2进行操作和评价。7.8
26、 试验报告试验报告中应给出下列信息za) 试验材料名称;b) 批号;c) 试验和对照样品制备;d) 试验步骤;e) 试验部位观察记分Ff) 结果评价。8 急性全身毒性试验8. 1 方法提要本试验系将试验样品注入小白鼠静脉和腹腔内，在规定时间内观察小白鼠有无毒性反应和死亡情况，以评价试验材料是否具有潜在的急性全身毒性作用。8.2 试剂质量浓度为9g/L的氯化铀注射液、新鲜精制植物油。8.3 主要设备和器具压力蒸汽灭菌器、动物天平、小白鼠固定器、注射器。8.4 试验前准备8.4. 1 器具灭菌与试验和对照样品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121.C30 rnin。8.4.2 试验动物准备8.4.
27、2. 1 试验采用健康、初成年小白鼠，同一品系并同一来源，雌鼠元孕，体重17g-23 g。试验前使小白鼠造应实验室环境。做过本试验的小白鼠不得重复使用。8.4.2.2 每种浸提液用小白鼠10只，随机分为试验样品和对照样品两组，每组5只。复试时每组取18 g-19 g的小白鼠10只。8.5 试验和对照样晶制备按GB/T16886. 12规定选择适宜的浸提条件，每种试验材料制备质量浓度为9g/L的氯化铀注射液和植物油两种浸提液。同批号浸提介质作为对照样品。8.6 试验步骤8.6. 1 样品注射8.6. 1. 1 自尾静脉分别注入氯化铀注射液浸提液和介质对照液，以不超过o.1 rnL/s的恒定速度注
28、射，注射剂量为50rnL/kg. 8.6. 1.2 由腹腔分别注入植物油浸提液和介质对照液，注射剂量为50rnL/kg。8.6.2 注射后观察注射完毕后，观察小白鼠即时反应，并于4h、24h、48h和72h观察和记录试验组和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数，在72h时称量动物体重。动物反应观察判定按表5规定。7 GB/T 16175-2008 表5毒性反应观察反应程度症状正常，元症状注射后元毒性症状轻微注射后有轻微症状但元运动减少、呼吸困难或腹部剌激症中度注射后出现明显的腹部剌激症状、抽搞、俯卧、呼吸困难、运动减少、眼险下垂或腹泻重度注射后出现虚脱、发钳、震颤或严重腹部剌激症状、腹泻
29、、眼险下垂或呼吸困难体重急剧下降，一般低于15g) 死亡注射后死亡8. 7 结果评价8.7. 1 在72h观察期内，试验组动物的反应不大于对照组动物，则判定试验样品元急性全身毒性反应。8.7.2 如试验组动物有2只或2只以上出现中度毒性症状或死亡，3只或3只以上出现体重下降超过10%，则判定试验样品有急性全身毒性反应。8.7.3 如试验组动物出现轻微毒性症状，或不超过1只动物出现中度毒性症状或死亡，或虽元毒性症状但组内动物体重普遍下降，则另取小白鼠10只为1组进行复试，复试结果符合8.7.1要求，判定试验样品元急性全身毒性反应。8.8 试验报告试验报告中应给出下列信息za) 试验材料名称:b)
30、 批号;c) 试验和对照样品制备;d) 注射剂量;e) 动物反应情况;f) 结果评价。9 亚急性(亚慢性)和惺性全身毒性试验9. 1 方法提要本试验通过将试验样品植入动物体内或注入动物静脉、腹腔、皮下、皮内或肌内，在规定试验周期内，测定试验样品一次或多次接触对试验动物的影响，以评价试验材料是否具有潜在的亚急性(亚慢性)或慢性全身毒性作用。注:也可采用其他符合GB/T16886.11要求的亚急性(亚慢性)和慢性全身毒性试验。本试验可设计成与植入试验结合进行。9.2 试剂质量浓度为9g/L的氧化铀注射液、新鲜精制植物油。9.3 主要设备和器具压力蒸汽灭菌器、动物天平、注射器。9.4 试验途径选择8
31、 试验接触途径应尽可能与试验材料的临床应用相关，可选择下列适宜途径进行试验zd 植入途径适用于植入材料;b) 静脉途径适用于直接或间接液路或与血液接触的材料;c) 腹腔途径适用于液路或与腹腔接触材料以及不宜静脉途径接触的试验样品pG/T 16175-2008 d) 皮下途径适用于皮下接触方式有利于评价材料毒性作用时zd 皮内途径适用于皮内接触方式有利于评价材料毒性作用时;f) 肌内途径适用于肌内接触方式有利于评价材料毒性作用时。9.5 试验组设定9.5.1 每一种试验样品应设立试验样品组和对照组。对照组动物除了不接触试验样品，其他处置方式应与试验组动物完全一致。9.5.2 除植入途径外，其他接
32、触途径的试验样品组一般宜设高、中、低3个剂量水平组，也可采用适宜的单剂量组试验(即限度试验)。选择剂量水平时应考虑临床接触剂量与安全应用因素，如采用加严剂量组时应考虑下列参数:一临床接触表面积的倍数;一一接触周期的倍数;-一-浸提分数或具体化学物的倍数;一一24h接触期的倍数。注:与经典的化学物全身毒性试验不同，医用材料一般不会产生剂量反应作用，因此高剂量水平不一定必须产生毒性作用.然而，试验所采用的剂量范围宜提供有效的人体安全性极限评估。9.6 试验前准备9.6.1 器具灭菌与试验和对照样品接触的所有器具置压力蒸汽灭菌器内121C30 min。9.6.2 试验动物选择9.6.2. 1 应按G
33、B/T16886.11的要求选择试验动物。植入途径首选家兔，静脉、腹腔、皮下、皮内、或肌内途径接触首选小白鼠或大自鼠。试验应采用健康、初成年动物，同一品系并同一来源，雌性动物未产并无孕。家兔体重在2.0kg-3. 0 kg起围内;啃齿动物最好在离乳后6周龄内，不大于8周龄;犬最好4月-6月龄，不大于9月龄;试验开始时，所用动物体重差异应不超过平均体重的士20%。每一试验剂量组需要的动物数量根据试验目的来确定，推荐的动物种属和每剂量组最少动物数量见表6。表6动物种属和数量试验类型啃齿动物性口小白鼠、大自鼠)非啃齿类动物如家兔、犬亚急性毒性10只(雄、雄各5只)a6只(雄、雄各3只)a亚慢性毒性2
34、0只(雄、雄各10只Y8只(雌、雄各4只)a慢性毒性40只(雄、雄各20只)b. a亦可采用单一性别动物，如预期试验材料仅用于女性时，试验应采用雌性动物.b采用加严剂量组时动物数量可减少至雌、雄各10只。c慢性毒性试验动物的数量应能保证可以对试验结果进行适当的统计学评价。二一9.6.2.2 应在试验前使试验动物适应实验室环境。9. 7 试验和对照样晶制备9.7. 1 采用植入方式时按GB/T16886.6的规定制备适宜的试验和对照样品。9.7.2 采用静脉注射途径时选择适宜的浸提条件，可用质量浓度为9g/L的氧化铀注射液制备试验样品。同条件制备浸提介质对照液。9.7.3 采用腹腔、皮下、皮内注
35、射途径时选择适宜的浸提条件，根据试验评价目的可用质量浓度为9 g/L的氯化锅注射液和(或)植物油制备试验样品。同条件制备浸提介质对照液。9.7.4 采用肌内注射途径时选择适宜的浸提条件，可用质量浓度为9g/L的氯化铀注射液制备试验样品。同条件制备浸提介质对照液。9 GB/T 16175-2008 9.8 试验步骤9.8. 1 试验接触9.8. 1. 1 体内植入时按GB/T16886. 6和本标准第12章的规定进行。对照组可植入阴性对照样品，或不植人对照样品仅进行与试验样品相同的手术步骤。9.8.1.2 静脉、腹腔、皮下、皮内或肌内注射途径接触时，试验样品组和介质对照组分别自动物的静脉、腹腔、
36、皮下、皮内或肌内注入试验样品和介质对照液。单次静脉快速注射时一般在1min内注射完毕，亦可根据试验样品具体情况采用慢速注射，大白鼠静脉注射速度通常不超过2mL/min.各动物种属最大注射剂量体积见表7.表7最大注射剂量体积动物种属静脉注射体积/(mL/kg)腹腔注射体积/(mL/kg)皮下注射体积/(mL/kg)肌内注射体积/(mL/kg)小白鼠50 50 50 2 大白鼠40 20 20 1 兔10 20 10 1 犬10 20 2 1 注:晴齿动物肌内注射时推荐小白鼠每一注射点不超过0.1mL，大白鼠每一注射点不超过0.2mL. 9.8.2 接触周期9.8.2.1 除植入途径外，其他接触途
37、径一般每周7d进行试验操作，较长期接触试验也可根据试验样品具体情况每周操作5d. 9.8.2.2 亚急性全身毒性试验接触周期为14d28 d，静脉接触时大于24h.但小于14d。亚慢性全身毒性试验接触周期啃齿动物通常为90d，其他种属动物不超过其寿命期的10%，静脉接触时为14 d-28 d。慢性全身毒性试验接触周期一般为6个月12个月。9.8.3 接触后观察9.8.3.1 体重和饲料、水消耗试验接触前及试验终结时应测量体重，试验期间至少每周测量一次动物体重。必要时长期接触试验应考虑测定饲料和水的消耗量。9.8.3.2 临床观察每日观察和记录试验样品组和对照组动物的一般状态，如皮肤、被毛、眼和
38、薪膜改变，以及呼吸、循环、自主和中枢神经系统、躯体运动神经活动性和行为表现等状况。必要时，在接触试验样品之前和试验期间对高剂量组和对照组动物进行眼科检查，如发现有眼部改变迹象时应检查全部试验动物。记录死亡的动物数并及时进行尸检，垂死动物及时隔离并处死。9.8.3.3 临床病理学检查应根据试验样品预期毒性作用，在试验接触周期内和(或接触终结时，选择进行下列适宜的检查项目za) 血液学方面，包括z凝血(PT、APTT)、血红蛋白浓度、血细胞比容、血小板计数、红细胞计数、白细胞计数和白细胞分类计数等;b) 临床血液生化方面，包括电解质平衡、碳水化合物代谢和肝、肾功能。某些试验样品由于其特定的作用模式
39、，可能还需测定自蛋白、ALP、ALT、AST、钙、氯化物、胆固醇、肌酸膏、GGT、葡萄糖、无机磷、饵、锅、总胆红素、总蛋白、甘油三醋、尿氮、各种酶类等。需评价免疫毒性时可考虑测定总免疫球蛋白水平。注z可根据试验接触周期确定适宜的检查次数，如试验周期为26周时在试验进行到13周时安排检查一次.尿液检验不作为常规捡验，仅在预期或观察到有这方面的毒性反应的情况下才考虑进行。检验时在试验接触的最后一周在一定时间间隔内(如16h24 h)采集尿液，推荐检验的项目包括外观、胆红素、尿糖、酣体、隐血、蛋白、沉渣、比重或渗量、尿量等。9.8.3.4 大体病理学检查GB/T 16175-2008 试验终结时，将
40、全部试验动物无痛处死后进行大体尸捡，包括体表及体表开孔、头部、胸(腹腔及内脏等。将试验动物的肾上腺、脑、附辜、心脏、肾、肝、卵巢、脾、辜丸、胸腺和子宫在取出后尽快称量其湿重。根据试验材料预期作用途径选择需进一步进行组织病理学检查的器官或组织，取下后置于适宜的固定液中。9.8.3.5 组织病理学检查应对高剂量组和对照组动物的器官和组织进行完整的组织病理学检查。应对全部显示有大体损害迹象或尺寸改变的器官和组织进行检查。如设有中、低剂量组，应对动物肺脏进行组织病理学检查是否有感染迹象，还应考虑对中、低剂量组进行肝、肾组织病理学检查，高剂量组如显示损害迹象应进行器官组织病理学检查。9.9 结果评价9.
41、9.1 列表给出各种试验数据，并采用适宜的统计学方法对数据进行分析评价。9.9.2 分析评价试验接触剂量与毒性反应产生的相关性、异常反应的发生率和严重程度，包括行为和临床性异常、大体损害、显微镜下改变、靶器官的鉴别、死亡率、以及任何其他有意义的一般性和特异性反应。9. 10 试验报告试验报告中应给出下列信息za) 试验材料名称;b) 批号;c) 试验动物;d) 试验和对照样品制备ze) 试验步骤;f) 观察记录;g) 结果评价。10 热原试验10. 1 方法提要本试验系将试验样品注入家兔静脉，在规定的时间内观察家兔体温升高的情况，以评价试验材料是否具有潜在的致热作用。10.2 试剂质量浓度为9
42、g/L的元菌元热原氯化铀注射液。10.3 主要设备超净工作台、电热干燥箱、电热恒温水浴箱、压力蒸汽灭菌器、热原测试仪、动物天平、注射器、家兔固定器。10.4 试验前准备10.4. 1 器具除热原与供试液接触的所有玻璃器皿置电热干燥箱内180C干烤至少2h，或250.C干烽至少30min。也可采用其他适宜的方法除热原。10.4.2 测温器具家兔体温测试应使用精密度为土O.l.C的热原测温仪或胆门体温计。11 GB/T 16175-2008 10.4.3 实验室环境10.4.3.1 在试验前1d-2 d，供试用家兔应处于同一温度环境中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5.C，实验室温度应为17C-
43、28.C。10.4.3.2 在试验全过程中，室温变化应不大于3.C，避免噪音干扰。10.4.4 试验用家兔按中华人民共和国药典二部附录XID的规定挑选试验用兔。10.5 试验样晶制备按第4章中的规定选择适宜的浸提条件，采用质量浓度为9g/L的无菌元热原氯化铀注射液制备试验样品。10.6 试验步骤按中华人民共和国药典(二部)附录XID的规定进行，家兔注射剂量为10mL/峙。10.7 结果评价试验样品经初试或复试后符合中华人民共和国药典(二部附录XID的规定时，判定试验材料无致热作用。10.8 试验报告试验报告中应给出下列信息:a) 试验材料名称;b) 批号;c) 试验样品制备;d) 注射剂量;e
44、) 家兔体温记录50 结果评价。门遗传毒性试验注:也可采用其他经确认符合GB/T16886.3要求的遗传毒性试验。11. 1 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验11. 1. 1 方法提要本试验是在有或元代谢活化系统的情况下，通过试验样品诱导组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌的突变情况，以评价试验材料潜在的致突变性。本标准推荐的是平板掺入法。注:其他信息参见OECD导则471.11. 1. 2 主要设备超净工作台、电热干燥箱、恒温培养箱、恒温水浴箱、恒温振荡水浴箱、压力蒸汽灭菌器、低温高速离心机、低温冰箱(-80.C)或液氮罐、匀浆器。11. 1.3 活化系统、培养基和试剂试验用活化系统(S9
45、和S9混合液、培养基和试剂按附录B的规定制备或购买市售产品。11. 1.4 菌株及其鉴定和保存11.1.4.1 菌株本试验用于测试试验样品诱变性时应至少采用四个菌株，本试验推荐五株鼠伤寒抄门氏菌突变菌株:TA98、TA100、TA1535、TA1537、TA1538。适当时也可采用其他菌株，如TA97、TA102等。11. 1.4.2 菌株特性菌株特性应与表8相符。突变型菌的某些特性易丢失或变异，在下列情况下应鉴定菌株的基因型za) 在收到培养菌株后zb) 当制备一套新的冷冻保存或冰冻干燥菌株时z12 。当每皿自发回变数不在正常范围时Ed) 当对诱变剂丧失敏感性时;e) 使用主平板传代时;f)
46、 投入使用前。表8菌株鉴定结果基因型商株组氨酸脂多糖R因子缺陷屏障缺失b抗氨苦青霉素)CTA98 + + + TA100 + + + TA1535 + + TA1537 + + TA1538 + + a +表示需要组氨酸。b +表示有抑制带.c +表示具有R因子。d +表示无修复能力.e 该数值为参考值，可在验证的基础上确定本实验室的规定数值范围.11. 1. 4. 3 菌株鉴定方法11. 1. 4. 3. 1 增菌培养GB/T 16175-2008 uvrB 自发回变菌落数e修复缺陷d+ 30-50 + 120-200 + 10-35 + 3-28 + 7-25 在5mL营养肉汤培养基中接种
47、贮存菌培养物，于(37士2)C、(115r/min-125 r/min)振荡培养10 h-12 h。11.1.4.3.2 组氨酸缺陷型的鉴定加热融化底层培养基两瓶(一瓶不加组氨酸，一瓶加组氨酸)，不加组氨酸者每100mL底层培养基中加0.5mmol D-生物素0.6mL;加组氨酸者每100mL底层培养基中加L-组氨酸每100mL中含0.404 3 g)1 mL和0.5mmol D-生物素0.6mL，冷却至50C左右，各倒两个平皿。接种z取有组氨酸和无组氨酸培养基平皿各一个，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线(直线接种在培养基表面，3TC培养48h. 结果判定z五株菌在有组氨酸培养基平皿表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基平皿上除自发回变菌落外元菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陆型。11. 1.4.3.3 脂多精屏障缺陷的鉴定加热融化营养肉汤培养基。接种:取菌液0.1mL移人平皿，迅速将营养肉汤琼脂培养基(冷却至50C左右)适量倒入平皿，混匀，平放凝固。将一片无菌滤纸片放入已凝固的培养基平皿中央，用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液10L，37C培养24h，每个菌株做一个平皿。结果判定z阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa(深粗型)突变。TA98、TA100、TA1535、TA1537、TA1538均有抑制带，野生型鼠伤
