1、ICS 65120B 46 a亘中华人民共和国国家标准GBT 2 1 033-2007饲料中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法2007-06-2 1发布Determination of immunoglobulin in feedsHigh-performance liquid chromatography2007-090 1实施宰瞀徽鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会仅1”刖 罱GBT 21033-2007本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准负责起草单位：国家饲料质量监督检验中心(武汉)、武汉恩彼生物科技有限责任公司。本标准主要起草人：刘小敏、周增太、何一帆、高利红
2、、杨林。饲料中免疫球蛋白IgG的测定高效液相色谱法GBT 2 1 033-20071范围本标准规定了用高效液相色谱仪测定饲料中免疫球蛋白IgG含量的方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、含IgG的饲料原料(包括血浆蛋白粉等)中免疫球蛋白IgG的测定。最低检出限为5 pg(取样1 g，最低检出浓度为5 mgkg)。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682
3、 分析实验室用水规格和试验方法GBT146991饲料采样GBT 20195动物饲料试样的制备3原理根据高效亲和色谱的原理，在磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白IgG与配基连接，在pH25的盐酸甘氨酸条件下洗脱免疫球蛋白IgG。4试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水为去离子水或相当纯度的水，应符合GBT 6682二级用水的规定。41磷酸二氢钾。42磷酸氢二钾。43流动相A：pH65，005 molL磷酸盐缓冲液。44流动相B：pH25，005 molL甘氨酸盐酸缓冲液。45 IgG储备标准液：称取IgG标准品(纯度95)o010 0 g，用流动相A(43)溶解并定容至100 mL，摇
4、匀，浓度为10 mgmL。46gG工作标准溶液：取IgG标准储备液，用流动相A(43)稀释成含IgG 02，04，06，08，10 mgmL的标准系列。临用时配制。5仪器和设备51实验室常用仪器设备。52 pH计。53超纯水装置。54匀浆机。GBT 21033-200755高效液相色谱仪：具紫外检测器和梯度洗脱装置。6试样制备按GBT 146991采样，按GBT 20195选取饲料样品至少500 g，四分法缩减至少100 g，磨碎，通过028 mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。7分析步骤71试样处理称取一定量试样(精确至0000 1 g)(配合饲料、浓缩饲料称取试样2 g5 g
5、；血浆蛋白粉称取试样01 g；鸡蛋粉称取试样05 g)于茄形瓶中，准确加入250 mL流动相A(43)，用匀浆机匀浆5 rain，取溶液10 mL于离心管中，以1 000 g(3 500 rmin)离心10 min。通过045zm微孔滤膜后进样。72测定721 HPLC测定参数的设定色谱柱：Pharmacia HITrap Protein G柱，1 mL。波长；280 nm。进样量：20 pL。722梯度洗脱条件梯度洗脱条件见表1。表1梯度洗脱条件时间min 流速(mLmin) 流动相A 流动相B0 05 100 045 05 100 055 O5 0 100150 05 0 100185 0
6、5 100 0260 05 100 O723测定7231先用5倍柱体积的重蒸馏水或去离子水洗柱，再用10倍柱体积流动相A(43)平衡柱，按洗脱程序进行洗脱。7232分别取71试样处理液和46标准工作液进行测定。以色谱峰面积积分值做单点或多点校准定量。8结果计算81试样中IgG含量m，以质量分数表示，数值以表示，按式(1)计算：m一等等熹等嚣 。一下五5双可又而 ”1)式中：P，试样峰面积值；V试样体积，单位为毫升(mL)；c标准工作液(46)中IgG的浓度，单位为毫克每毫升(mgmL)；V，。标准工作液进样体积，单位为微升(pL)；P。标准工作液峰面积值；m称取试样的质量，单位为克(g)；2(；BT 21033-2007v。试样进样体积，单位为微升(LL)。82平行测定结果用算术平均值表示，保留小数点后两位有效数字。9重复性在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值不得超过算术平均值的15。
