1、ICS 65120B 46 雷雪中华人民共和国国家标准GBT 21 1072007动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法Identification of horse and donkey derived materials in animaloriginatedfeedstuffsPCR method20071024发布 200B一04-0 1实施丰瞀鹊鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会及111刖 肓GBT 21 1072007本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共
2、和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国青岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：宗卉、曾少灵、温燕辉、徐宝梁、高宏伟、陈颖、吴亚君、郑秋月、曹际娟。本标准首次发布。1范围动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法GBT 21 1072007本标准规定了动物源性饲料中马、驴(Equoidea)源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为01(质量分数)。本标准适用于动物源性饲料中马、驴源性成分的定性检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内
3、容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 6682分析实验室用水规格和试验方法GBT 146991饲料采样(GBT 146991SNT 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31聚合酶链式反应polymerase chain reaction；PCR用于扩增位于两段已知序列之间DNA(deoxyribonucleosidea acid，脱氧核糖核酸)的方法。模板DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别与
4、模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸)为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个30个扩增循环，扩增倍数达到约106。4原理利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料51525354除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB 6682的要
5、求。马、驴源性成分检测用引物(对)序列为：5tgccacagttggatacatcaac 35。attgagattaggcgattgtt 3Taq DNA聚合酶(Thermus aquaticu，水生栖热菌)。限制性内切酶：Sau3A酶，Alu I酶。dNTPs：dATP(deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidine triphosGBT 21 1072007phate，脱氧胸苷三磷酸)、dcTP(deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸)、dGTP(deoxyguan。sinetriphospha
6、te，脱氧鸟苷三磷酸)。55琼脂糖：电泳纯。56溴化乙锭。57三氯甲烷。58异丙醇。59 70乙醇。510分子量标准品(100 bp2 000 bp)(bp：base pair，碱基对)。511裂解液：1CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，005 molL TrisHCI(pH8o)-Tris-：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三(羟甲基)氨基甲烷，07 molL NaCI，001 molL EDTA(pH80)(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)。512 TE
7、缓冲液(Tris HCl、EDTA缓冲液)：10 mmolL TriwHCl(pH80)，1 mmolL EDTA(pH8O)。513 10PCR缓冲液：100 mmolL KCI，160 mmolL(NH4)2so,，20 mmolL MgSO,I，200 mmolLTris-HCl(pH88)，lTriton X-100(t_octylphenoxyp01yethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇)，l mgmL BSA(bovine serum albumin，牛血清蛋白)。514 电泳缓冲液：，Ihs 54 g，硼酸275 g，05 moUL TE缓冲液(pH80)20 mL，
8、加蒸馏水至1 000 mE；使用时10倍稀释。515溴化乙锭贮存液：10 mgmL水溶液。516加样缓冲液：025溴酚蓝，40(质量浓度)蔗糖。517酶切缓冲液：10 mmolL Tris HCI(pH75)，10 mmolL MgCIz，50 mmolL NaCI，01 rngmL BSA。6仪器设备61 DNA热循环仪。62离心机(离心力12 0009)。63核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。64 微量移液器(o1 pL2弘L，05 pL10 pL，2 pL20 pL，10弘L100 tLL，20 pL200 pL，200弘L1 000 pL)。65电泳仪。66紫外检测仪。67 pH计。68
9、恒温水浴锅。69天平(感量001 g)。7试样选取与制备按照GBT 146991采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。8检验步骤81样品的总DNA提取称取适量饲料(饲料粒度为20目称取200mg，60目称取100mg，100目称取50rag)于15mL离心管中，加入600 pL800 pL裂解液，6530mln，期间不时振荡混匀；12 0009离心5min；转移上清于洁净离心管中，加400 pL三氯甲烷+异戊醇(24+1)，混匀；12 0009离心5 min，取上清液；加08倍体积异丙醇，沉淀；12 0009离心5 min，弃上清液；70乙醇洗涤一次，晾干；加入50 pL TE，溶解沉淀
10、。2GBT 2”072007也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。82 DNA浓度和纯度的测定取5 pL DNA溶液，用ddH。O(double distilled water，双蒸水)稀释至1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检测260 nm和280 nm处的吸光值Am和A：。DNA的浓度按式(1)计算：cAxN501 000 (1)式中：cDNA浓度，单位为微克每微升(pg肛L)；A260 nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当Az。A：。比值为1719之间时，适宜于PCR扩增。83 PCR扩增50 pL反应体系：10PCR缓冲液5 pL、dNTPs(5 mmolL)1 tLL、引
11、物对(51molL)各2 tzL、TaqDNA聚合酶(5 UuL)05弘L、模板DNA(100 ng土50 ng DNA)10 pL、ddH20 315 pL。反应条件：PCR反应条件随仪器不同略有改变。94预变性1 min3 min。94变性30 s60 S，57退火30 s60 S，72延伸30 s60 S，30个循环。72延伸5 min。4保存。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含马或驴源性成分的样品作阳性对照，用已知不含马和驴源性成分的样品作阴性对照，用等体积的ddH。O代替模板DNA作空白对照。84 PCR扩增产物电泳检测取20 g琼脂糖，于100 mL电泳缓冲液中
12、加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为05 btgmL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5 pL8 pL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9 Vem恒压电泳，至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。85限制性内切酶酶切及产物电泳检测PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。反应体系(50 pL)：Sau3A酶1 pL(10 UuL)，酶切缓冲液5 tLL，PCR扩增产物20 pL，ddHzO24 pL。充分混匀反应液，37水浴1 h，65水浴5 rain终止酶切反应。酶切完成后电泳，方法见84。9结果判断与表述91
13、 PCR扩增产物电泳检测结果马和驴源性成分的PCR扩增产物大小均为294 bp(序列参考附录A)。92限制性内切酶酶切电泳检测结果马源性成分的PCR扩增产物经Sau3A限制性内切酶酶切后，片段大小为226 bp和68 bp。驴源性成分的PCR扩增产物经AluI限制性内切酶酶切后，片段大小为113 bp和181 bp。93结果表述PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含有马、驴源性成分，表述为未检出马、驴源性成分。PCR扩增产物电泳检测结果阳性，限制性内切酶酶切产物片段大小正确，判为含有马或驴源性成分，表述为检出马或驴源性成分。10检蒉过程中防止交叉污染的措施按照SNT1193执行。11废弃物处
14、理检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。GBT 211072007附录A(资料性附录)PCR产物测序结果马：TGCCACAGTT GGATACATCA ACATGATTTA TTAATATCGT CTCAATAATCCTAACTCTAT TTATTGTATT TCAACTAAAA ATCTCAAAGC ACTCCTATCCGACACACCCA GAACTAAAGA CAACCAAAAT AACAAAACAC TATGCCCCTTGAGAATCAAA ATGAACGAAA ATCTATTCGA ATCTTTCGCT ACCCCAACAATAGTAGGCCT CCCTATTGTA ATTC
15、TGATCA TCATATTTCC CAGCATCCTATTCCCCTCAC CCAACCGACT AATCAACAAT CGCCTAATCT CAAT驴；TGCCACAGTT GGATACATCA ACATGATTTA TTAATATCGT CTCAATAATCCTAACTCTAT TTATTGTATT CCAACTAAAA ATTTCAAAGC ACTCTTATCCAATACACCCA GAAGCTAAAA CAACTAAAAT AGCTAAACGC CTTACCCCTTGAGAATCAAA ATGAACGAAA ATCTATTCGC CTCTTTCGCT ACCCCAACAATAATAGGCCT CCCTATTGTA ATCCTAATCA TTATATTCCC CAGCATCCTATTTCCCTCAT CCAACCGACT AATTAACAAT CGCCTAATCT CAAT
